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小鼠GITRL基因真核表达质粒的构建转染及其在Kupffer细胞中的表达
目的 构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,体外转入小鼠Kupffer细胞.方法 利用PCR方法扩增GITRL基因,克隆至pEGFP-N1载体,选择阳性克隆并进行序列测定.以脂质体化学法转染至Kupffer细胞中.结果 构建了真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外瞬时转染Kupffer细胞,RT-PCR及WB检测该Kupffer细胞表达GITRL.结论 成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,并在小鼠Kupffer细胞成功表达,为进一步研究GITRL在Kupffer细胞中的的生物学功能提供研究基础.
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糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子配体调控炎症反应的机制
目的 探讨库普弗细胞中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子配体(GITRL)调控炎症反应的机制.方法 分离小鼠库普弗细胞和T细胞,转染库普弗细胞并与T细胞共培养,将共培养细胞分为6组:空白对照组,共培养细胞只加DMEM培养基；大肠埃希杆菌脂多糖(LPS)组,共培养细胞培养基中加入1 mg/L的LPS；沉默组、沉默对照组、质粒转染组、空载体质粒组,各组的库普弗细胞分别转染GITRLsiRNA、control siRNA、pEGFP-N1 GITRL、pEGFP-N1 control后与T细胞共培养后再加入LPS(1 mg/L),置孵箱培养24 h后处理.细胞免疫荧光法和Western blot法分别检测库普弗细胞的GITRL和程序性死亡配体(PDL1)的表达,MTT法和Annexin V/FITC染色流式分析仪分别检测T细胞增殖和凋亡,ELISA法检测上清液TNFα的含量.数据分析采用独立样本t检验和单因素方差分析(N-K检验).结果 转染24 h后荧光显微镜观察转染细胞荧光强度初步判断转染GITRL siRNA和转染pEGFP-N1 GITRL的库普弗细胞转入效率分别为90％和85％.转染GITRL siRNA的库普弗细胞GITRL蛋白表达较正常库普弗细胞显著下降,而转染pEGFP-N1 GITRL的库普弗细胞GITRL蛋白表达较正常库普弗细胞显著升高(=41.72,13.10,P＜0.05)；各转染对照库普弗细胞的GITRL蛋白表达与正常库普弗细胞比较,差异无统计学意义(F=2.27,P＞0.05).LPS组GITRL荧光强度明显高于空白对照组(t=49.29,P＜0.05)；与LPS组比较,沉默组GITRL的表达明显下降(t =9.84,P＜0.05)；质粒转染组中GITRL的表达明显增加(=5.78,P＜0.05)；各转染对照组(沉默对照组、空载体质粒组)中GITRL的表达与LPS组比较,差异无统计学意义(F=0.86,P＞0.05).LPS组PDL1蛋白的表达与空白对照组比较明显下降(t=18.83,P＜0.05)；与LPS组比较,质粒转染组中PDL1蛋白的表达下降更明显(t=11.79,P＜0.05)；沉默组PDL1蛋白的表达则介于LPS组和质粒转染组之间(t=19.08,P＜0.05)；各转染对照组(沉默对照组、空载体质粒组)与LPS组比较,差异无统计学意义(F=2.22,P＞0.05).LPS组与空白对照组比较,T细胞增殖明显增加,凋亡显著减少(t=49.43,40.11,P＜0.05)；与LPS组比较,质粒转染组T细胞增殖和凋亡表现为更明显的相同趋势(t=5.77,12.64,P＜0.05)；而沉默组T细胞的增殖减少而凋亡明显增加(t=17.00,49.90,P＜0.05)；各转染对照组(沉默对照组、空载体质粒组)与LPS组比较,差异无统计学意义(F=1.87,1.35,P＞0.05).LPS组与空白对照组比较,TNF-α的表达明显增加(t=125.68,P＜0.05)；与LPS组比较,沉默组TNF-α显著下降(t=119.65,P＜0.05)；质粒转染组TNF-α则显著增加(t=147.70,P＜0.05)；各转染对照组(沉默对照组和空载体质粒组)与LPS组比较,差异无统计学意义(F=0.14,P＞0.05).结论 库普弗细胞通过上调GITRL的表达抑制PDL1,激活T细胞增殖,促进炎症反应；干扰GITRL的表达可恢复免疫平衡,抑制炎症反应.
关键词： 脓毒症 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子配体 程序性死亡配体 库普弗细胞 T细胞
