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Deaf1的功能结构域分析和预测
目的 分析转录因子Deaf1的功能结构域并预测其功能.方法 利用现有的数据库和软件对Deaf1的转录因子结构域,核定位信号及和输出信号进行分析和预测.结果 Deaf1含有一个保守的SAND结构域及一个能介导蛋白质-蛋白质相互作用的MYND结构域;有核定位信号和核输出信号;在其N端还有一个富含丙氨酸结构域.结论 Deaf1除有典型转录因子必需的功能结构域之外,可能还有不止一个结构域能介导与其它蛋白质因子的相互作用,这对Deaf1调控外周组织抗原表达至关重要.
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畸形表皮自调节因子1相关功能蛋白的筛选
目的 获得畸形表皮自调节因子1(DEAF1)稳定高表达的HEK293T细胞株,通过免疫共沉淀(Co-IP)和质谱分析技术筛选能与DEAF1相互作用的蛋白质因子.方法 用TurboFect转染试剂将pEGFP-mDEAF1和pEGFP-N1质粒分别转染HEK293T细胞和2F-2B细胞、荧光显微镜观察DEAF1在2种细胞中的定位.将质粒p3×FLAG-mDEAF1分别转染HEK293T和2F-2B细胞株,同时设置相应未转染的空白对照组;通过反转录PCR法和实时定量PCR(qRT-PCR)检测DEAF1在2种细胞中mRNA表达水平,通过Western blot法检测DEAF1在2种细胞中蛋白表达水平.p3×FLAG-mDEAF1质粒转染HEK293T细胞,G418筛选阳性克隆,Western blot法、免疫荧光染色和流式细胞术鉴定DEAF1稳定表达的HEK293T-DEAF1细胞株.抽提HEK293T-DEAF1细胞和正常HEK293T细胞的核蛋白,用EZviewTM Red ANTI-FLAG M2亲和珠子进行Co-IP,SDS-PAGE分离, 挑选明显富集和对照泳道没有的条带进行质谱分析,明确DEAF1的相关功能蛋白.结果 荧光显微镜下可见DEAF1定位于细胞核;反转录PCR、qRT-PCR检测发现转染组DEAF1的mRNA表达水平明显高于未转染组;Westernrn blot法检测发现转染组有融合蛋白mDEAF1-FLAG表达,成功获得稳定高表达DEAF1的HEK293T-DEAF1细胞.经Co-IP筛选和质谱分析,得到一些DEAF1的相关功能蛋白,如前mRNA处理所需的因子及酶,参与起始后RNA聚合酶,参与肽键断裂、蛋白空间结构形成的分子和其他转录因子等.结论 成功获得稳定高表达DEAF1的HEK293T-DEAF1细胞,经Co-IP筛选和质谱分析获得了一些DEAF1相关的功能蛋白.
