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规律成簇的间隔短回文重复/Cas9文献资料
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应用规律成簇的间隔短回文重复/Cas9构建敲除趋化因子受体4的人胶质瘤U251细胞
目的 运用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9基因编辑技术构建敲除趋化因子受体4 (CXCR4)基因的人脑胶质瘤U251细胞.方法 设计3对针对目标基因CXCR4的导向RNA(sgRNA),通过PX335质粒构建3组该基因的Cas9表达载体(CXCR4-sgRNA-1、CXCR4-sgRNA-2、CXCR4-sgRNA-3),测序验证后,将构建正确的载体CXCR4-sgRNA-1转染进至U251细胞,T7核酸内切酶Ⅰ (T7E1)酶切鉴定敲除效率,分离单克隆细胞5组进行培养,分别测序及蛋白印迹法鉴定其敲除效率和蛋白含量,获得稳定敲除阳性单克隆细胞.结果 测序验证CXCR4-sgRNA-1组载体构建成功,转染载体后U251细胞经聚合酶联反应(PCR)酶切鉴定敲除效率为48％,其2、3、4、5号单克隆细胞敲除效率分别为20％、40％、30％、20％.PCR产物连接T载体后测序,结果显示3组出现点突变,2号为A突变为G,4号为T突变为C和5号为A突变为G,而3号单克隆敲入38 bp碱基,确定为有意义的突变.2、3、4号单克隆细胞CXCR4蛋白表达量为0,敲除组CXCR4蛋白相对表达量较对照组明显降低(0比0.746±0.010,P=0.000),差异有统计学意义.免疫印迹结果说明敲除CXCR4基因的U251细胞株内无CXCR4蛋白的表达;测序比对得到有效的敲除细胞株.结论 通过CRISPR/Cas9系统高效地获得了靶向CXCR4重组质粒,并且筛选出稳定敲除CXCR4表达的U251细胞株.
关键词： 胶质瘤 规律成簇的间隔短回文重复/Cas9 趋化因子受体4
