首页 > 文献资料
-
抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的构建、表达与纯化
目的 制备重组抗白细胞介素4受体(recombinant anti-interleukin-4 receptor,anti-IL-4R)单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)与蜂毒肽(melitin,MLT)的融合蛋白.方法 设计并合成抗IL-4R单链抗体基因与蜂毒肽基因,再用1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定;通过重叠延伸PCR(gene splicing by over lap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR)技术将抗IL-4R单链抗体基因与蜂毒肽基因连接成scFv-MLT融合基因,并以1% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定;scFv-MLT融合基因连接pET-32a原核表达载体以构建重组质粒,并用 EcoRⅠ和 XhoⅠ内切酶进行酶切鉴定;将重组质粒转入BL21(DE3)原核表达菌感受态细胞,37℃环境下培养于含有羧苄青霉素(100 μg/mL)的平板TB固体培养基表面,分离出单菌落;挑取单菌落接种于含有羧苄青霉素(200 μg/mL)TB液体培养基中,于通气良好的37℃环境下培养,使其 A600nm值达到0.4~0.6,用浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG诱导表达scFv-MLT融合蛋白;3 h后达到表达高峰,离心沉淀菌体并将其裂解,提取所有蛋白并进行 scFv-MLT 融合蛋白纯化和复性;通过 SDS-PAGE 分析scFv-MLT融合蛋白的分子量,运用Western blot检测表达蛋白的特异性.结果 scFv-MLT基因序列大小约1000bp, IL-4R单链抗体与蜂毒肽重组蛋白的分子量在48~63 kD之间,与预期分子量52 kD相符,scFv-MLT融合蛋白具有较高的特异性.结论 成功制备了scFv-MLT重组蛋白,为进一步研究抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽的融合蛋白的靶向生物治疗奠定了工作基础.
