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Calphostin C抑制脂肪分化相关蛋白诱导的ACAT1表达
目的 我们已经发现adipophilin通过改变乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)的表达来促进细胞内脂质蓄积,病理状态下形成泡沫细胞,成为动脉粥样硬化的始动因素.本研究旨在探讨该过程所涉及的信号通路,阐明adipophilin引起细胞内脂质积聚的机制.方法 通过克隆adipophilin基因,构建逆转录病毒载体pQCXIP-HA-Adi,使用siRNA技术构建pSuper-retro-adipophilin siRNA逆转录病毒载体,包装病毒后,感染RAW264.7细胞,筛选后获得高或低表达adipophilin的细胞.将该细胞分别与300 nmol/L PKC抑制剂Calphostin C孵育16 h或同时再加入50 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育,应用RT-PCR和Western blot检测细胞内ACAT1的表达.当低表达adipophilin的细胞与Calphostin C共孵育时,在不同的时间点取样,RT-PCR和Western blot检测各时间点细胞内ACAT1的表达.结果 高表达adipophilin细胞中ACAT1表达增加,低表达adipophilin细胞中ACAT1表达减少.无论在高或低表达adipophilin的细胞中,Calphostin C能够抑制ACAT1的表达,与不孵育Calphostin C组相比差别有显著性.与ox-LDL孵育使高表达adipophilin的细胞荷脂,同样能够发现Calphostin C抑制ACAT1的表达.低表达adipophilin的细胞与Calphostin C共孵育1h后,ACAT1 mRNA开始下降；孵育8h后,ACAT1蛋白开始下降；孵育16 h后ACAT1 mRNA及蛋白表达均明显下降,与对照组相比差别有显著性.高及低表达adipophilin或负荷脂质状态下,Calphostin C能够时间依赖性的抑制ACAT1的表达.结论 adipophilin引起细胞内脂质积聚的机制可能是,PKC信号分子作用于adipophilin,并进一步影响ACAT1的表达,终导致细胞内脂质积聚.
