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CUL53'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与MiR-148a-3p靶向验证
目的:构建CUL5基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-148a-3p与CUL5的靶向关系.方法:利用生物信息学软件预测miR-148a-3p与CUL5结合位点;利用PCR扩增CUL5基因3'-UTR序列,将其克隆到pmiR-RB-ReportTM双荧光素酶报告基因载体中,同时构建CUL53'UTR突变载体;将miR-148a-3p及阴性对照分别与野生型has-CUL5-wt 3'-UTR及突变型has-CUL5-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性.结果:Targetscan、PicTar、miRanda、PITA、miRDB数据库预测结果显示,miR-148a-3p与CUL5基因3'UTR存在互补结合位点.酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性实验表明,miR-148a-3p mimics能够与CUL5基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性;对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光活性有所上升.结论:miR-148a-3p能够与CUL5靶向性结合,CUL5是miR-148a-3p新的靶基因.
关键词： CUL5 3'UTR 双荧光素酶报告载体 miR-148a-3p
