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人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达
目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达.方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG 1-shRNA486,TDRG 1-shRNA738,TDRG 1-shRNA921和一个阴性对照,使用LipofectamineTM 12000转染shRNA至NTERA-2细胞,应用RT-PCR法检测转染后NTERA-2细胞TDRG1 mRNA的表达水平.结果:经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.同时筛选到转染TDRG 1-shRNA486的NTERA-2细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制.结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1的shRNA表达载体,TDRG 1-shRNA在NTERA-2细胞内成功表达.
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人睾丸特异表达基因TDRG1单克隆抗体的制备及鉴定
目的:构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性.方法:用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达TDRG1重组蛋白.以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体(mAb).ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性. 结果:成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白.筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×10~6,免疫球蛋白类型均为IgG_1类.Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白.结论:所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体.
