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IPS-1基因缺失突变体真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建干扰素β启动刺激因子1(IPS-1)的300～444位氨基酸缺失突变体重组质粒,并初步鉴定.方法 通过重叠延伸PCR法获得缺失300～444位氨基酸的突变体△IPS-1,构建缺失突变体重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1,并经XbaⅠ及claⅠ双酶切及测序鉴定.结果 双酶切缺失突变体重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1后,琼脂糖凝胶电泳可见1 250 bp附近的片段.DNA测序结果做BLAST分析,显示重组质粒含有1 266 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了缺失300～444位氨基酸的IPS-1基因重组真核表达载体pEF-BOS-FLAG-△IPS-1.
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IPS-1基因缺失突变体对IFN-β诱生作用及抗HSV-1病毒作用的影响
目的:初步研究缺失300-444位氨基酸突变体△IPS-1对IFN-β诱生作用及抗HSV-1病毒作用的影响,进而确定该部位对IPS-1发挥正常功能的作用.方法:通过重叠延伸PCR法获得缺失300～444位氨基酸的△IPS-1,构建突变重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1,并经酶切及测序鉴定.采用磷酸钙体外转染HEK293T真核细胞.经Western blot检测蛋白的表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β分泌量;HSV-1病毒感染分别转染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1、pEF-BOS-FLAG/△IPS-1质粒的HEK293T细胞,空斑检测各转染细胞组不同时间段细胞上清的病毒滴度.结果:成功构建了缺失300～444位氨基酸的IPS-1基因重组真核表达载体pEF-BOS-FLAG/△IPS-1;与转染pEF-BOS-FLAG/IPS-1质粒组相比转染了pEF-BOS-FLAG/△IPS-1的细胞在不同时间段其上清中IFN-β分泌量有一定量的减少;空斑测定结果表明转染了pEF-BOS-FLAG/△IPS-1质粒组细胞中病毒滴度明显高于pEF-BOS-FLAG/IPS-1质粒组.结论:△IPS-1与IPS-1相比能使HEK293T细胞IFN-β分泌量明显减少,△IPS-1不能完全抑制HSV-1感染细胞产生的细胞病变效应,该突变体抗HSV-1病毒作用有一定程度的减弱.
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MDA5与抗病毒感染信号转导
MDA5是胞内模式识别受体,能够识别入侵病毒RNA链,主要在非髓系细胞系中发挥抗病毒作用.MDA5包括3个功能区域:CARD、DExD/H以及无功能RD.CARD与DExD/H分别发挥信号传递与ATP水解功能,无功能RD主要使MDA5基于病毒5’-ppp末端不同识别单股正链RNA病毒中的EMCV；MDA5能通过CARD结构域与线粒体结合的接头蛋白IPS-1相互作用,激活转录因子IRF-3/IRF-7,诱导其核转位促进β干扰素的表达,从而启动固有免疫应答.此外,还可以通过FADD依赖途径产生NF-κB,调控炎症反应因子表达.本文综述MDA5在结构、识别病毒及其信号转导等方面的研究新进展.
