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大鼠海马神经元PKCε特异性shRNA对神经元突起生长的影响
目的 构建shRNA特异性干扰海马神经元内PKCε,研究PKCε干扰后海马神经元突起长度的变化.方法 设计并构建PKCε的小分子干扰shRNA载体.分别在293T细胞中共转染PKCε和各干扰片段,Western blot验证干扰效果.将有干扰作用的载体转染海马神经元,用细胞免疫荧光法验证干扰内源PKCε的效果.激光共聚焦显微镜观察并统计海马神经元突起生长的变化.结果 海马神经元内部PKCε被干扰,干扰发生24 h后海马神经元突起的长度与scvamble对照相比,差异有统计学意义(P ＝ 0.02)、48 h后二者的差异无统计学意义(P ＝ 0.343).结论 海马神经元内PKCε被成功干扰,干扰后PKCε对神经元突起生长有抑制作用.
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通过设计发夹RNA抑制HIV病毒NEF基因表达的实验研究
目的 实验研究shRNA能否抑制宿主细胞Hele细胞中NEF基因的表达.方法 给HIV病毒宿主细胞Hele细胞加入预先设计好的4对shRNA,同时设置对照组,提取细胞总RNA和细胞总蛋白,设计NEF和GAPDH的引物,利用SYBR Green实时荧光定量PCR检测NEF的基因水平,利用western blotting检测NEF的蛋白水平.结果 定量PCR和Western-blot方法检测显示,NEF-miRNA-1、NEF-miRNA-2、NEF-miRNA-3、NEF-miRNA-4干扰质粒对靶基因mRNA表达都有抑制作用,其中NEF-miRNA-3干扰质粒抑制作用显,抑制率达87％.结论 可以通过设计shRNA去抑制HIV病毒的复制.
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人核迁移蛋白shRNA慢病毒载体的构建及转导
目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导.方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA干扰载体,通过磷酸钙转染法,将获得的慢病毒高纯度质粒转染进低次代293T细胞中进行包装,通过高速离心收获慢病毒颗粒,经滴度测定后,对Dami巨核细胞进行转导实验.用显微镜观察转导效率,用Wesernblot检测RNA干扰效果.结果:慢病毒携带的shNUDC-F片段对Dami巨核细胞能高效转导,并使其内源hNUDC基因发生基因沉默,干扰效果较好.结论:成功构建出慢病毒hNDUC RNA干扰载体,并在293T细胞中实现包装并成功转入Dami细胞.
