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miR-184对小鼠神经干细胞增殖的影响及其机制
目的 观察miR-184对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响及其机制. 方法 构建包装pHBLV-U6-GFP-miR-184基因过表达和PHBLV-U6-G FP-s h-mi R-184基因干扰慢病毒载体和各自对照无义序列慢病毒载体,分离培养孕14d的CD1胎鼠大脑侧脑室下区的NSCs并鉴定.实验细胞分为过表达对照组、miR-184过表达组、干扰对照组和miR-184干扰组,各组细胞在感染对应的慢病毒后,用嘌呤霉素进行抗性筛选.筛选后,继续培养细胞至3代,实时定量PCR进行miR-184过表达验证.通过targetScan、iRTarBase、miRanda等软件预测miR-184的靶基因并进行内源性验证,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)细胞渗入实验观察各实验组的增殖情况,通过Westernblotting实验和实时定量PCR观察各组Notch信号通路相关蛋白Hes1和Hes5及其mRNA的表达情况. 结果 免疫荧光染色显示,90％的分离培养细胞呈巢蛋白(nestin)和Y性别决定转录因子2(Sox2)双阳性,miR-184过表达组的miR-184表达量是过表达对照组的(67.63±7.53)倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).Brdu细胞渗入实验结果显示与各自对照组比,miR-184过表达组的细胞增值率是过表达对照组的(1.47±0.05)倍,而miR-184干扰组的细胞增值率是干扰对照组的(0.84±0.03)倍,差异均具有统计学意义(P＜0.05).iRTarBase和miRanda软件预测,Numblike蛋白(Numbl蛋白)作为miR-184的潜在靶基因,miR-184可以下调Numbl蛋白的表达,miR-184过表达组和miR-184干扰组的Numbl相对表达量分别是各自对照组的(0.73±0.07)倍、(1.30±0.05)倍,差异均具有统计学意义(P＜0.05),但miR-184并不能改变Numbl mRNA的表达水平.miR-184可抑制Numbl蛋白的表达,使Notch信号通路的下游相关蛋白Hes1和Hes5及其mRNA表达升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05). 结论 miR-184通过在蛋白翻译水平抑制Numbl蛋白的表达,从而激活Notch信号通路,促进NSCs的增殖.
