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mIκBα基因转染肝癌细胞HepG2的放射增敏作用
目的 探讨mIκαBα基因是否增加肝癌细胞的放射敏感性.方法 实验分3组:亲本细胞对照组、nepG2细胞转染Adv组、转染mIκBα基因的Hep G2细胞-Ad mIκBα组.在6 Gy X射线照射前后分别测定3组细胞下列指标:Western blot检测肝癌细胞浆内mIκαBα值;电泳迁移率法测定肝癌细胞核内NF-κB活性;TUNEL染色法测定肝癌细胞凋亡指数.2 Gv放射线照射后的肝癌细胞存活分数和用多靶单击模型确定的Do、Dq值判定肝癌细胞的放射敏感性.结果 放射线照射前,Adv组与Hep G2组细胞浆内mIκBα呈低值,照射后更减低;而细胞核内NF-κB活性照射前为(+),照射后为(++),呈持续激活状态;细胞凋亡指数在照射前分别为1.4、1.6,照射后升高至8.9、11.7.Ad mIκBα组在照射前、后细胞浆内mIκBα均呈高值,均为Adv组的3倍;而细胞核内NF-κB活性在照射前、后均呈阴性;照射前细胞凋亡指数为18.2,照射后升高至88.3.3组中Ad mIκBα组细胞存活分数低,为0.301;而SER(放射增敏比)大,为2.099;Do值小,为1.468.Dq值小,为0.709.结论 用mIκBα基因转染肝癌细胞Hep G2,可抑制肝癌细胞内NF-κB的抗凋亡活性.增强肝癌细胞的放射敏感性.
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大肠杆菌内同源重组法构建含mIκBα基因的重组腺病毒及其在Hep G2细胞中的表达
目的通过在大肠杆菌内同源重组,快速、有效地制备含人mIκBα基因的腺病毒重组体的方法,并观察其在肝癌细胞株Hep G2细胞中的表达.方法首先将目的基因mIκBα克隆进结合有绿色荧光蛋白报告基因的穿梭质粒 -pAdTrack-CMV中,将新形成的质粒pAdTrack-CMV-mIκBα用限制性内切酶PmeI线性化后,再与腺病毒骨架质粒-pAdEasy-1一同转化进大肠杆菌株BJ5183细胞中.用对卡那霉素抗性挑选重组体质粒-pAd-mIκBα,并通过限制性内切酶分析,确认重组.后将线性化后的重组体质粒转染进腺病毒包装细胞株293细胞.腺病毒重组体Ad-mIκBα在7～10 d内产生.借助GFP的表达,测定和观察在293细胞中重组腺病毒的滴度及其在HepG2细胞中的表达.结果经PCR检测提示重组体腺病毒含有mIκBα基因.Ad-mIκBα的滴度是2.7×109PFU/ml.当MOI等于10时,在HepG2细胞中,Ad-mIκBα病毒可有效和稳定地表达,其感染效率24 h为57%,48 h达100%.结论运用在大肠杆菌内同源重组法能有效和方便地构建含目的基因mIκBα的腺病毒重组体Ad-mIκBα.该重组体能在293细胞中扩增,并有效地感染Hep G2细胞.为进一步研究mIκBα基因的功能和该基因治疗肝癌提供了一个良好的基因转导载体.
