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核转录因子及其突变基因的克隆与GST融合蛋白的表达纯化及磷酸化活性的检测
目的:原核表达IκBα及κBα (S32,36A)基因,纯化获得GST-IκBα及GST-Iκ Bα (S32,36A)融合蛋白.方法:利用PCR扩增含有酶切位点EcoR Ⅰ及NotⅠ的IκBα基因,将其装入pGEX-5X-1原核表达载体中.通过点突变获得pGEX-5X-1-Iκ Bα(S32,36A)质粒.将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21 (DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达蛋白,再用Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST融合蛋白,后通过Western Blot鉴定纯化后的融合蛋白.结果:成功构建了pGEX-5X-1-IκBα及pGEX-5X-1-IκBα (S32,36A)原核表达载体.在37℃条件下,0.lmmol/L的IPTG能够诱导表达大量可溶性GST-IκBα与GST-IκBα (S32,36A)蛋白;纯化的融合蛋白可被抗IκBα的单克隆抗体特异性识别.后通过体外激酶试验验证了IκBα能被HeLa细胞中存在的上游激酶所磷酸化,而第32,36位丝氨酸突变后IκBα不具有磷酸化活性.结论:纯化的GST-IκBα/Iκ Bα (S32,36A)蛋白具有生物学活性,可用于后续的生物学研究.
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突变型nm23-H1基因的磷酸化活性研究
背景与目的 磷酸化活性是nm23-H1重要的生物学活性,本研究旨在探讨不同位点的突变对nm23-H1磷酸化活性的影响.方法 以野生型nm23-H1研究对照,采用放射自显影的方法检测nm23-H1野生型(WT)和4种突变型(P96S,H118F,S120G和S44A)原核表达蛋白的自身丝氨酸与自身组氨酸磷酸化活性,应用反相高效液相色谱技术(RP-HPLC)检测上述蛋白的NDPK激酶活性.结果 野生型和突变型nm23-H1蛋白的自身丝氨酸与自身组氨酸磷酸化活性由大到小依次为P96S、WT、S44A、S120G和H118F,而NDPK活性由大到小依次为:WT、S120G、P96S、S44A和H118F;经线性相关分析,自身丝氨酸与组氨酸磷酸化活性呈正相关(r=0.983,P<0.01),但NDPK活性与自身丝氨酸和自身组氨酸活性均无相关性(分别为r=0.458,P>0.05;r=0.482,P>0.05).结论 不同位点的突变对nm23-H1自身丝氨酸、自身组氨酸及NDPK激酶活性影响不同,NDPK活性与自身磷酸化活性并不完全关联.其中118位组氨酸是nm23-H1激酶活性的关键氨基酸;96位脯氨酸可能与nm23-H1的磷酸转移能力有关;而120位丝氨酸可能为自身丝氨酸和组氨酸磷酸化位点;44位丝氨酸可能为另一具有NDPK激酶的氨基酸.
