首页 > 文献资料
-
PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究
[目的] 利用聚合酶链反应(PCR)技术对Wilson病(WD)基因进行体外定点突变的研究.[方法] 采用PCR定点突变技术,首先设计两对引物,将突变位点设计在引物上,通过重叠延伸法两次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中.[结果] DNA测序表明在预期位点已经发生突变,WD基因第778位密码子由精氨酸(Arg)残基突变为亮氨酸残基(Leu),用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体.[结论] PCR技术诱导定点突变准确、高效.Wilson病基因突变体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础.
关键词： 肝豆状核变性/遗传学 聚合酶链反应 定点诱变 -
应用USE定点诱变技术制备Wilson病突变体
[目的]克隆 Wilson病( WD)基因的全长 cDNA,制备 WD的突变体,为进一步研究突变蛋白的功能奠定基础.[方法]采用 RT-PCR和 TOPO-TA克隆技术,克隆了全长 WD cDNA,并以此为膜板应用 USE定点诱变技术(特异性位点抹除技术)构建了 778位( CGG→ CTG)、 1069位( GTG→ GTC)两个突变体.[结果]成功克隆了 WD cDNA,并经过全长测序没有发现突变的存在.以此为模板制备了 WD基因 8号外显子第 778位密码子由 CGG突变为 CTG、 14号外显子 1069位 GTG→ GTC的突变体,从而构建了含中国人和欧美 WD基因的高频突变点.[结论]USE定点诱变技术是寡核苷酸引物诱变技术的一个重大的改进,该技术采用双位点同时突变的方法,经两次酶切,两次转化,选择效率很高.
关键词： 肝豆状核变性/遗传学 定点诱变 -
肝豆状核变性分子生物学研究
【目的】 探讨中国人肝豆状核变性(WD)的分子发病机制 和基因诊断的方法。【方法】 应用基因工程技术对WD进行了10年的分子生物学研究。【结 果】 ①WD的基因定位研究：通过RFLP及微卫星多态性分析，应用两位点及多位 点连锁软件，建立了中国人WD基因在D13q14.2-3区域的精细遗传连锁图谱， 从 而首次对中国人WD基因进行了精确定位；②WD基因突变研究：应用PCR-SSCP及DNA测序技术 ，对39个家系45名WD患者进行该致病基因的21个外显子突变筛选，发现WD基因5号外显子存 在新的T插入突变，并证实中国人WD基因的突变热点为8号外显子，突变形式为Arg778Leu， 其频率为22.8%；③WD的症状前诊断和杂合子检出：应用DNA重组技术对79个家系进行基因 诊断，成功地进行了WD的症状前诊断和杂合子检出，并建立了WD的基因筛选的PCR-Msp 1酶切方法。【结论】 中国人WD基因定位与白种人基本相同，但基因突变热点不同，其发病 机制存在差异，从而基因诊断的方法也不同。
关键词： 肝豆状核变性/遗传学 分子生物学 基因突变 肝豆 状核变性/诊断
