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利用Tet-on诱导基因表达系统构建EID3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立
目的 构建类E1A细胞分化抑制因子3(EID3)真核表达载体,并转染人乳腺癌细胞(MCF-7),建立Tet-on诱导表达的目的基因EID3的稳定转染细胞系.方法 应用PCR技术,得到目的基因EID3的cDNA,通过双酶切、胶回收方法纯化目的片段EID3.DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pLVu-Tight-Puro,经菌落酶切、电泳以及测序鉴定.将真核表达质粒pLVu-Tight-Puro-EID3和pLVX-Tet-On Advanced Vector转染MCF-7细胞,分别通过G418和嘌呤霉素选择培养,建立由四环素(doxycycline,DOX)诱导表达的稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测目的基因EID3在DOX诱导下mRNA以及蛋白的表达.结果 成功构建了pLVu-Tight-Puro-EID3表达质粒,并建立了由DOX诱导表达的稳定转染细胞系,可在DOX诱导下稳定表达EID3基因的mRNA及蛋白.结论 人EID3稳定表达细胞系为研究EID3基因在肿瘤辐射敏感性及药物敏感性的作用提供实验基础.
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EID3基因在大肠癌传代细胞mRNA的表达及其克隆
目的 研究新的大肠癌相关性抗原EID3基因的克隆及其诊断价值.方法 用SEREX技术筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库,发现了一类似于肿瘤抑制基因(E1A基因)的EID3基因(NM-001008394.1),构建原核表达载体pET32k-EID3,IPTG诱导重组EID3蛋白质的表达,并利用Ni NTA His Bind树脂纯化该重组蛋白质.用RT-PCR技术研究EID3 mRNA在正常组织和大肠癌传代细胞的表达.结果 经PCR扩增成功获得1 002 bp的人EID3基因,测序正确.在大肠杆菌中目的 蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为39 000 KD,纯化后的6xHis EID3纯度可达92%.通过RT-PCR分析发现,EID3基因在43例大肠癌传代细胞株中有39例阳性,阳性率为90.7%.在正常组织中,除睾丸组织不表达或有极低水平转录外,余均不表达.结论 EID3基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤诊断和肿瘤多肽疫苗治疗研究奠定了基础.EID3 mRNA表达检测用于诊断大肠癌,可能具有高特异性和高敏感性的特点.EID3蛋白在大肠癌患者中能够诱导机体的抗体免疫应答,可能成为一个新的大肠癌相关性抗原分子,其用于诊断大肠癌的可行性,有待进一步深入研究.
