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难转染悬浮细胞 OCI -LY8慢病毒过表达稳定细胞株的构建
目的：探讨难转染悬浮细胞慢病毒过表达稳定细胞株的构建方法。方法选用人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞株OCI-LY8为研究对象，分别用Fbw7基因的慢病毒原液、慢病毒浓缩液、慢病毒浓缩液加入终浓度为5μg/mL的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（polybrene）、慢病毒浓缩液加入终浓度为10μg/mL的polybrene 4种方式进行感染。因慢病毒载体含有绿色荧光蛋白报告基因，故通过倒置荧光显微镜观察细胞内荧光的数量及强度来评判上述4种方式的感染效率，并用Real-time PCR和Western blot进行验证。结果慢病毒原液的感染效率极低，仅在少许细胞中看到极微弱的荧光；慢病毒浓缩液的感染效率尚可，约有60％的细胞可以观察到微弱的荧光；慢病毒浓缩液中加入5μg/mL polybrene的感染效率较高，约90％的细胞可以观察到较强的荧光；慢病毒浓缩液中加入10μg/mL polybrene的感染效率极高，几乎全部细胞均可以观察到很强的荧光。结论慢病毒浓缩液中加入合适浓度的polybrene是感染DLBCL细胞株OCI-LY8较为有效的方法。慢病毒的感染效率与细胞的状态、感染复数、polybrene的浓度密切相关。
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稳定过表达XAF1基因鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株的构建
目的：构建稳定过表达X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（ X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1，XAF1）基因的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。方法分别将携带XAF1基因感染复数（ multiplicity of infection，MOI）为50的慢病毒稀释液、MOI为100的慢病毒原液和MOI为100的慢病毒原液加入终浓度为5μg/mL的聚凝胺（ polybrene）转染人鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。通过倒置荧光显微镜观察细胞内荧光数量及强度评判转染效率，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（ real-time quantitative reversetranscription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白免疫印记法（ western blot）检测XAF1基因mRNA和蛋白的表达。结果慢病毒稀释液转染，约60％的细胞可观察到微弱荧光；慢病毒原液转染，约70％的细胞观察到较弱荧光；慢病毒原液加入5μg/mL polybrene的转染效率较高，约90％的细胞观察到较强荧光。嘌呤霉素筛选上述转染效率高的慢病毒原液加5μg/mL polybrene组细胞，其成功将携带XAF1基因的慢病毒转入鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。 qRT-PCR和western blot进一步证实细胞株稳定过表达XAF1基因。结论慢病毒加polybrene转染可成功构建稳定过表达XAF1基因的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。
