您当前的位置：
首页 > 文献资料
所属专业：
VEGFA-siRNA文献资料
-
针对小鼠VEGFA基因的siRNA干扰载体的构建和慢病毒包装
目的 针对NM_001025250.3,NM_001025257.3,NM_009505.4,构建4个针对靶基因小鼠VEGFA(血管内皮生长因子A)的小干扰RNA(siRNA)干扰载体,并将其重组转成慢病毒载体.方法 根据靶基因设计并合成4对siRNA干抚序列,将siRNA干扰序列克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建4个干扰质粒,转化入感受态细胞DH5α.干扰载体瞬时转染靶细胞同时设阴性对照质粒组和不转染组,并通过qPCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果.使用Gateway重组技术将筛选出的干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-MR2构建慢病毒表达载体pLentii6.3-VEGFA-MR2.用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(packaging mix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度.结果 成功构建针对靶基因的4个干扰质粒分别为:pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-MR1,pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-MR2,pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-MR3和pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-MR4;其中MR2干扰载体的基因沉默效果佳,干扰质粒转染小鼠肺癌细胞LLC后,检测干扰载体对于靶基因的沉默效果为58.43%;慢病毒滴度为7.5×10(8)TU/ml.结论 成功构建、筛选针对小鼠VEGFA基因沉默的特异性siRNA慢病毒.
关键词： RNA干扰 VEGFA-siRNA 慢病毒
