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锅柄聚合酶链反应法扩增贵阳腐霉 Pr1基因上游未知序列
目的：在灭蚊真菌贵阳腐霉Pr1基因已知序列的基础上，利用锅柄聚合酶链反应法扩增Pr1基因上游未知序列。方法首先采用限制性内切酶BamHⅠ对基因组DNA进行完全酶切，用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后，与5′磷酸化的寡核苷酸链连接，经过变性、链内退火和聚合酶延伸形成锅柄状，后进行嵌套式PCR。结果获得了Pr1基因已知序列上游864bp核苷酸序列，GenBank登录号为：JQ975036。结论锅柄聚合酶链反应法可以高度有效地扩增与已知位点相邻的基因组片段，是一种可靠的染色体步移法，有利于Pr1基因全长的克隆。
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Pythium sp. GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析
目的 克隆Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因.方法 在已经克隆得到的Pythi-um sp.GYl938菌株类枯草菌素蛋白酶cDNA片段的基础上,首先通过PCR扩增得到与其相对应的基因组DNA片段,然后分别通过Mini基因组DNA文库法和Panhandle PCR法扩增其上游和下游未知片段,后通过PCR法扩增得到类枯草菌素蛋白酶基因片段.结果 克隆得到1 519bp Pr1蛋白酶基因序列YP1977,DNAassist软件分析其中含有一个969bp的完整的开放阅读框,编码323个氨基酸,NCBI BkastX比对结果显示,该阅读框可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶都具有较高的同源性.结论 YP1977很可能是Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的部分片段,但仍需要进一步通过构建表达系统加以验证.
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贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达
目的:实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease, Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达,验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员.方法:(1)提取贵阳腐霉总RNA,以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增Pr1基因ORF片段;(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,转化表达菌株E.coli ER2566,IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶.结果:成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达.结论:证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区.
