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1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建
目的 构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体.方法 聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向.后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序.结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源.结论 本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 tat基因 分泌型真核表达载体 -
重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测
目的：构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达，检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pcDNA3．1（＋）/Tat中扩增tat基因，利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ，获得正向插入克隆（pSecT at ）和反向插入克隆（pSecTat-AS），经双酶切鉴定连接成功后，利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞，利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞，CAT-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞内CAT表达，从而检测Tat蛋白的活性。后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养，CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带，与预期的324 bp大小相符；经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定，获得2个正向克隆；正向克隆经测序，克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100％同源。正向克隆质粒转染293细胞后，Western blot法检测观察到约19×103蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT 表达量高于反向克隆质粒转染细胞（P＜0．05）。与反向克隆对照相比，与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高（P＜0．05）。结论成功构建 HIV-1 tat基因基因分泌型真核表达载体，该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的T at蛋白，表达的T at蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。
关键词： 人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因 分泌型真核表达载体 调控活性
