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中国部分地区HIV患者B'和B'/C亚型毒株tat第一外显子基因变异与HIV疾病进展关系的研究
目的 了解中国B'和B'/C亚型HIV/AIDS患者tat第一外显子的基因序列及其二级结构的特征和变异特点,探讨其与HIV-1感染疾病进展之间的关系.方法 从辽宁、吉林和云南省HIV-1感染者中选取病情呈缓慢进展的B'亚型感染者8例和B'/C亚型感染者5例,选择年龄、性别感染时间与前二者匹配的病情呈典型进展的B'亚型感染者26例和B'/C亚型感染者9例.采集外周静脉血,提取前病毒DNA,用巢式聚合酶链反应扩增HIV-1的tat基因,纯化后直接进行基因序列测定,序列编辑后翻译成氨基酸序列,进行氨基酸变异情况分析和二级结构预测.结果 B'和B'/C亚型缓慢进展者、典型进展者Tat第一外显子中发现多种氨基酸替换,但除A58T外均未显示出与病毒载量以及疾病进展的明确相关性.23N、31S、32Y、46F变异均显示出亚型特异性;Tat蛋白的二级结构未发现规律性变化.结论 中国HIV/AIDS患者tat第一外显子某些位点的基因变异,如A58T可能与病毒载量以及疾病进展有关,Tat蛋白的二级结构可能与HIV感染后的疾病进展无明显关系.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 tat基因 变异 二级结构 -
脑脊液来源人类免疫缺陷病毒tat真核表达载体的构建及鉴定
目的：探讨脑脊液来源人类免疫缺陷病毒（HIV）tat真核表达载体的构建，并研究TAT蛋白在真核细胞的表达。方法从脑脊液中扩增出HIV tat基因，构建pcDNA-tat真核表达载体，所构建载体经酶切和测序鉴定。将构建的表达载体转染293T细胞系，通过免疫荧光检测TAT蛋白的表达。结果成功扩增tat基因，酶切和测序结果证实正确构建了表达载体pcDNA-tat，免疫荧光证实所构建载体能在293T细胞中有效表达HIV TAT目的蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA-tat，为了解HIV在中枢神经系统的潜伏机制奠定实验基础。
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中国HIV/AIDS患者tat第一外显子基因变异特点与疾病进展关系的研究
目的了解中国HIV/AIDS患者tat第一外显子的基因序列的特征和变异特点,探讨其与HIV-1感染者疾病是展之间的关系.方法选取40例辽宁和吉林HIV感染后临床进程不同的人抽取外周血,提取核酸,用套式聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1的tat基因,并进行核酸测序,生成系统进化树.结果长期不进展者、无症状感染者及AIDS患者的tat基因序列与相应亚型的国际流行株序列比较,各组均存在与流行株序列不一致的氨基酸变异,而且某些变异具有组间特异性.在系统树分析中各组聚集在一起,呈混合分布.结论中国HIV/AIDS患者tat第一外显子一些位点的基因变异可能与疾病进展有关,某些位点的基因变异可能会降低病毒的复制能力.
关键词： 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 tat基因 变异 亚型 -
HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定
目的:在大肠埃希菌中表达人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活蛋白(trans activative transcription protein,Tat),为进一步研究可溶性Tat在艾滋病相关卡波氏肉瘤(AIDS-KS)致病过程中的作用提供材料.方法:以本实验室保存的重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat101为模板,PCR扩增目的基因Tat.将PCR产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-Tat.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定后,通过镍亲和层析柱纯化.纯化后蛋白采用虫荧光素酶报告实验进行功能验证.结果:限制性内切酶酶切和基因测序证实,成功构建了含有Tat基因的重组原核表达质粒.蛋白质印迹结果显示,His融合蛋白在大肠埃希菌中得到正确表达,纯化后获得了相对分子质量为18×103的融合蛋白.虫荧光素酶报告实验证实,Tat与HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)具有结合能力.结论:重组质粒pET-28a(+)-Tat能在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定表达Tat蛋白,镍亲和层析柱纯化的His-Tat融合蛋白具有生物学功能.
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Ⅰ型人类免疫缺陷病毒tat基因重组慢病毒表达载体的构建
目的 构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因重组慢病毒表达载体.方法将pCDH-GFP和pCDH-RFP载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切制备线性化载体;通过设计引物及PCR扩增,获得5′端与3′端分别与15nt线性化载体3′端与5′端互补的tat基因片段;tat基因片段和线性化载体经纯化后,进行重组反应;将重组产物转化感受态细胞DH5α,通过菌落PCR、质粒双酶切、序列测定等方法 鉴定重组克隆.结果 菌落PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在约354bp位置出现预期的条带;EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒经琼脂糖凝胶电泳,在约7544bp和354bp位置上出现预期条带;通过测序,重组质粒中插入的tat基因序列与GenBank基因库中的HIV-1 tat基因序列同源.结论 采用本研究方法能成功构建HIV-1 tat基因重组慢病毒表达载体.
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1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建
目的 构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体.方法 聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向.后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序.结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源.结论 本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 tat基因 分泌型真核表达载体 -
重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测
目的：构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达，检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pcDNA3．1（＋）/Tat中扩增tat基因，利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ，获得正向插入克隆（pSecT at ）和反向插入克隆（pSecTat-AS），经双酶切鉴定连接成功后，利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞，利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞，CAT-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞内CAT表达，从而检测Tat蛋白的活性。后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养，CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带，与预期的324 bp大小相符；经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定，获得2个正向克隆；正向克隆经测序，克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100％同源。正向克隆质粒转染293细胞后，Western blot法检测观察到约19×103蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT 表达量高于反向克隆质粒转染细胞（P＜0．05）。与反向克隆对照相比，与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高（P＜0．05）。结论成功构建 HIV-1 tat基因基因分泌型真核表达载体，该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的T at蛋白，表达的T at蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。
关键词： 人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因 分泌型真核表达载体 调控活性 -
人类免疫缺陷病毒I型Tat基因真核表达载体的构建
目的:构建人类免疫缺病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达.方法:以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞.RT-PCR检测其基因转录情况,WesternBlot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达Hiv-1Tat目的片段. 结论:成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础.
