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人冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR检测方法的研究
目的 建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)和NL63 (HCoV-NL63)双重实时荧光RT-PCR检测方法.方法 根据GENBANK数据库中HCoV-HKU1和HCoV-NL63的基因序列,利用BIOEDIT5.0软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR扩增的引物.从特异性、低检测限、重复性等方面进行评估,建立了HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR检测方法.结果 分别以HCoV-HKU1和HCoV-NL63质粒为模板,HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR方法的低检测量分别为4.96×102 copies/ml和4.96×102 copies/ml.该方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号,特异性好.4个梯度稀释质粒样本的4次重复检测Ct值变异系数均＜5％,重复性好.结论 HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR方法准确性好、灵敏度高、稳定性好,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的监测中具有很好的应用前景.
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表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析
HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入.本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确.分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化).本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoVNL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础.
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深圳地区婴幼儿人冠状病毒NL63和HKU1的检测与分析
目的 了解深圳地区急性呼吸道感染婴幼儿人冠状病毒NL63 (HCoV-NL63)和人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)的感染情况及其感染所致疾病的临床特征和流行规律.方法 收集2010年10月-2011年6月因急性呼吸道感染(ARTI)而就诊于深圳市福田区妇幼保健院的0～6周岁患儿的咽拭子标本共179份,同时采集来院体检的0～6周岁健康婴幼儿的咽拭子86份作为健康对照组标本；根据文献资料合成引物及探针,采用荧光PCR方法分别检测标本中HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异性基因.结果 179份患儿标本共检出共检测到4份HCoV-NI63阳性,阳性率为2.22％ (4/179),1份HCoV- HKU1阳性,阳性率为0.56％ (1/179).健康对照组标本未检测出两种病毒.结论 深圳地区急性呼吸道疾病婴幼儿患者中存在感染HCoV-NL63和HCoV- HKU1的情况.冬春季可能存在一个HCoV-NIM3感染的高发期.
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清远地区急性呼吸道感染儿童人冠状病毒检测分析
目的 了解清远地区急性呼吸道感染婴幼儿人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63的感染情况和流行特征.方法 收集0～6周岁急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子标本,采用多重荧光PCR方法分别检测标本中的人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63.结果 共采集鼻咽拭子标本318份,检出人冠状病毒阳性数为36份,总阳性率为11.32％,人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63阳性率分别为2.83％、2.52％、1.89％和4.09％.男性组人冠状病毒阳性率为9.74％,女性组人冠状病毒阳性率为13.82％,不同性别4种人冠状病毒阳性率差异无统计学意义.0～5周岁年龄组均有检出入冠状病毒,但6周岁年龄组没有检出入冠状病毒.结论 清远市地区急性呼吸道感染婴幼儿患者中存在感染人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63的情况.
