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人冠状病毒OC43易感细胞系的高效筛选
为了筛选获得可用于人冠状病毒OC43 (Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)分离与研究的细胞系,本研究利用表达海肾荧光素酶基因的重组HCoV-OC43 (rOC43-ns2DelRluc)对28种常见真核细胞系进行了易感性高效筛选研究,进一步利用亲本病毒HCoV-OC43-WT进行了细胞病变效应的观察,并采用荧光定量PCR进行复制动力学分析.实验结果显示:18种细胞对HCoV-OC43易感,HCoV-OC43在其中5种细胞中表现出较强的复制能力,包括BHK-21、293T、Huh7.0、RD等常见贴壁细胞.复制高峰在第5d出现,但HCoV-OC43感染的细胞系在6d内均未观察到典型细胞病变效应.本研究为今后HCoV-OC43的复制规律、致病机制的研究以及筛选广谱抗冠状病毒药物的提供了参考细胞系.
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2013-2015年人冠状病毒OC43基因型分布特点的研究
目的 研究人冠状病毒(Human Coronavirus,HCoV) OC43的基因型分布特点,为阐明HCoV-OC43的分子流行规律提供数据参考.方法 从2013年-2015年HCoV-OC43检测阳性的呼吸道样本中提取核酸,用逆转录方法扩增cDNA,利用特异性引物扩增全长纤突蛋白基因(S)、聚合酶基因(RdRp)和核蛋白基因(N).用Mega 6.0软件进行序列拼接、进化树构建和S蛋白氨基酸比对.结果 从16份HCoV-OC43阳性样本中获得全长S、RdRp和N基因.其中2013年的1株为D基因型,2014年的8株均为D基因型,2015年的7株中包括3株B、3株D和1株E(CH)基因型.B和D基因型的S蛋白分别有9个和16个氨基酸位点的突变与分离年份有关,B基因型中氨基酸突变呈累加现象,D基因型中出现连续突变和回复突变.结论 HCoV-OC43表现为多基因型共流行,D基因型高流行.抗原蛋白S的氨基酸突变在各基因型流行中起重要作用.本研究为完善和丰富对HCoV-OC43的分子流行特征的认识提供了数据参考.
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携带绿色荧光蛋白报告基因的HCoV-OC43感染性克隆的构建与病毒拯救
目的：探索利用HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的可行性及插入区域。方法在HCoV-OC43全长感染性克隆pBAC-OC43 FL的基础上,利用融合PCR和酶切连接等方法,成功构建了在3个不同位置插入绿色荧光蛋白报告基因( GFP替换 NS2基因或NS12.9基因以及插入N基因后)的重组质粒,利用反向遗传学操作技术进行病毒拯救,通过免疫荧光、Western blot和病毒感染等试验对重组病毒进行鉴定分析。结果 GFP替换NS2或NS12.9基因的感染性克隆可以成功拯救出重组病毒(OC43-GFPΔNS2和OC43-GFPΔNS12.9),其中OC43-GFPΔNS2在感染BHK-21细胞后能够观察到GFP基因的高效表达,OC43-GFPΔNS12.9在感染细胞后仅有少量GFP基因的表达,而GFP插入N基因后的感染性克隆未能拯救出病毒。结论 NS2基因可以作为HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的插入位点,并且外源基因插入至该位点可获得稳定高效表达,为进一步研究HCoV-OC43的复制规律及研发基于HCoV-OC43的冠状病毒载体提供了参考依据。
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HCoV-OC43逃避人树突状细胞免疫清除机制的初步研究
目的:了解人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)逃避人树突状细胞(Dendritic cell,DC)免疫监视作用的初步机制.方法:利用HCoV-OC43阳性病人的标本感染BSC-1细胞分离OC43病毒,相差显微镜观察细胞病变(Cytopathic effect,CPE),实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)进行鉴定;利用人细胞因子GM-CSF和IL-4联合体外诱导DC分化,于诱导7 d后用HCoV-OC43病毒感染DC.采用透射电镜观察DC感染后的形态,Real-time PCR检测DC功能相关细胞因子的表达水平;流式细胞术检测DC比例及其功能相关共刺激分子的表达.结果:成功建立HCoV-OC43体外感染DC的体系.HCoV-OC43能感染DC并刺激其产生免疫应答,但培养上清中不能检测到病毒核酸;HCoV-OC43感染会导致DC细胞表达IFN-α、IFN-β、CCL3和CCL5的量显著下调,但其共刺激分子HLA-DR、CD1c和CD86的表达不受抑制. 结论:HCoV-OC43可感染人DC细胞并刺激其产生免疫应答,但不能产生活的子代病毒;HCoV-OC43可通过抑制宿主DC细胞IFN-α等相关炎症因子和趋化因子的分泌,来实现免疫逃逸.
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清远地区急性呼吸道感染儿童人冠状病毒检测分析
目的 了解清远地区急性呼吸道感染婴幼儿人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63的感染情况和流行特征.方法 收集0～6周岁急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子标本,采用多重荧光PCR方法分别检测标本中的人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63.结果 共采集鼻咽拭子标本318份,检出人冠状病毒阳性数为36份,总阳性率为11.32％,人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63阳性率分别为2.83％、2.52％、1.89％和4.09％.男性组人冠状病毒阳性率为9.74％,女性组人冠状病毒阳性率为13.82％,不同性别4种人冠状病毒阳性率差异无统计学意义.0～5周岁年龄组均有检出入冠状病毒,但6周岁年龄组没有检出入冠状病毒.结论 清远市地区急性呼吸道感染婴幼儿患者中存在感染人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和HCoV-NL63的情况.
