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重组抗原CP4-EPSPS的表达及免疫学活性研究
目的:表达并纯化重组CP4-EPSP合成酶(CP4-EPSPS),研究重组CP4-EPSPS的免疫学活性;为进一步制备单克隆抗体和开发检测CP4-EPSPS的快速诊断试剂奠定基础.方法:诱导表达含转基因大豆CP4-EPSPS的重组载体pET-EPSPS,经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析纯化,以ELISA、胶体金试条、Western杂交鉴定其免疫活性.结果:重组CP4-EPSPS以包涵体表达为主,上清表达量极低,但胶体金试纸条检测发现上清中CP4-EPSPS抗原活性强;复性包涵体的抗原性与上清的抗原性明显不同.采用扩大培养量、缩小超声破碎重悬体积的方法,从上清中纯化CP4-EPSPS获得成功,ELISA检测此重组抗原免疫小鼠血清抗体滴度可达到1:625,000;Western杂交证实重组抗原免疫血清与CP4-EPSPS标准品有较好的免疫反应性.结论:包涵体的简单复性方法难以恢复其关键的抗原决定簇的免疫原性;运用胶体金试纸条检测重组CP4-EPSPS活性,灵敏度高,简单快捷,对CP4-EPSPS特异检测相关的关键性抗原决定簇的甄别有重要作用,可指导重组抗原的纯化和在免疫学研究、特别是在单克隆抗体开发中的应用.
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抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定
目的:制备可用于胶体金快速检测试条的抗CP4-EPSPS(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法:以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析.结果:获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(Ⅲ5A3,Ⅲ13A2).其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1∶106和1∶108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上.ELISA相加实验结果显示2株mAb识别相同或相近的抗原表位.结论:成功地制备出抗CP4-EPSPS的2株mAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具.
