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3T3-fGFP细胞摄取神经干细胞胞外泌囊泡的途径
目的 以超速离心方案提取胞外囊泡的鉴定为基础,初步探求小鼠神经干细胞C17.2胞外囊泡与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-fGFP细胞之间的通讯交流通路.方法 分别用超速离心法获得胞外囊泡(EV)和Total Exosome Isolation Kit试剂盒获得外泌体(EXO);用透射电镜和原子力显微镜分别对两种样品进行形态学比较;用SDS-PAGE和Western blot分别对两种样品进行生物化学比较;用染料标记超速离心法获得胞外囊泡;将标记的胞外囊泡与3T3-fGFP细胞共孵育,对3T3-fGFP细胞摄取胞外囊泡进行研究;通过药理实验筛选3T3-fGFP细胞摄取胞外囊泡的主要通路.结果 C17.2细胞生长良好,形态规则未出现明显分化现象.在透射电镜下两种样品均观察到圆形双层膜结构和“杯状”外形的囊泡,直径分布多集中在300 nm以内,并且发现胞外囊泡的平均直径大于外泌体.原子力显微镜的结果显示,两种样品的高度分布多集中在2～20 nm以内,直径分布多集中在300 nm以内,并且外泌体的平均高度和平均直径均大于胞外囊泡.SDS-PAGE结果显示两种样品所含蛋白种类、表达丰度接近.在相同上样量下HSP70的表达强度两者接近,但CD63、CD9和CD81 3种蛋白在胞外囊泡中表达更强.摄取实验表明C17.2细胞胞外囊泡可以被3T3-fGFP细胞内化,被包裹在囊泡内,转运到细胞核周围的区域,并且摄取数量随着时间延长而增加(P＜0.05).通过药理实验确定网格蛋白(Clathrin)介导的内吞通路为3T3-fGFP细胞摄取C17.2细胞胞外囊泡的主要通路.结论 小鼠神经干细胞外泌体可能主要经网格蛋白介导的通路参与了神经干细胞与3T3-fGFP细胞的通讯.
关键词： 小鼠神经干细胞 胞外囊泡 3T3-fGFP细胞 网格蛋白介导通路
