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影响人胚胎脑组织冷藏因素的研究
人胎脑组织的良好保存是临床上中枢神经系统疾病或损伤的患者获得脑组织移植的根本保证.本人从事神经细胞冷藏技术多年,曾对人胎脑神经细胞的冷藏保存进行了系列研究.我们对人胎脑组织在4℃冰箱和-196℃液氮内保存、脑组织块与脑细胞悬液冷藏和人胎脑组织与大鼠胎脑组织冷藏后的活细胞成活率进行了比较,并对冷藏时合理控制温度下降速度进行了探索.收集2hr内水囊引产8～16W的人胚胎,在无菌条件下取大脑皮质或黑质,入不含钙镁的PBS中.将脑组织剪碎(脑组织块冷藏组被剪成2mm3小组织直接入MEM培养液)过200目尼龙网制成悬液,离心去上清后加入EME培养液并分装数管.取一管进行台盼蓝染色做细胞总数计数、活细胞及死亡细胞计数,为冷藏前对照.其余分别放入4℃冰箱保存和-196℃液氮内保存(先4℃ 10min,再入-20℃ 10min,然后再投入液氮中).这样可以合理的控制温度的下降速度,从而减少快速冷冻对细胞的损伤.结果表明,4℃冰箱保存组1～5d的细胞成活率明显高于液氮保存组.但5d后4℃冰箱保存组的细胞逐渐死亡,而液氮保存组细胞成活率并不随保存时间的延长而明显改变.因此 ,需要长期保存的脑组织以液氮冷藏为宜,而短期内将用于科研和临床的脑组织好采用4 ℃冰箱保存.我们在实验中发现,以脑组织块的形式放入培养液进行液氮冷藏,复苏后制成悬液在镜下观察,其细胞成活率高于悬液保存组,且细胞形态与冷冻前接近.其机制有待进一步探讨.冷藏前我们还对加有10%的二甲基亚砜的细胞悬液与未加组的细胞悬液进行了观察比较, 发现前者的细胞成活率略低于后者.我们认为二甲基亚砜对细胞可能有一定的毒性作用.我们还发现在同样条件下,大鼠脑组织冷藏后的细胞成活率高于人的脑组织细胞成活率.说明人的脑组织冷藏要求条件高、难度大.我们采用所掌握的冷藏技术已成功地将人胚胎黑质细胞移植到了大鼠帕金森氏病动物模型的脑中,并获得了预期的结果.
