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方法学优化文献资料
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乙肝病毒基因组序列扩增的条件优化和结果分析
目的 优化乙型肝炎病毒(HBV)不同长度基因片段PCR扩增条件,为后续机制研究提供实验基础.方法 运用PCR或巢式PCR(Nested PCR)方法扩增6例临床乙肝患者HBV DNA,针对特异性目的片段,通过优化Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶用量、DMSO浓度等,获得特异性扩增条带,PCR产物直接测序并使用CHROMAS、MEGA等生物学软件进行结果分析.结果 通过综合分析各种实验条件对PCR扩增结果的影响,终确认在50μL扩增体系中,2.5 mmol/L Mg2+、200 nmol/L特异性引物、1.5 U Taq酶、56℃退火在本实验室可获得良好的扩增效果,适量二甲基亚砜(DMSO)可减少非特异性干扰,同时建议对短片段可酌量减少Taq酶使用量.生物信息学分析示6例HBV感染标本中1例为B基因型,5例为C基因型,共发现S基因21个核酸变异及9个氨基酸可改变.结论 建立了适合本实验室的HBV DNA扩增体系以及后续生物信息学分析方法,明确了不同的扩增体系条件对PCR扩增效果具有重要影响.
