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TNF-α诱导滑膜MSCs与BMSCs凋亡的比较研究
目的 通过比较TNF-α诱导滑膜MSCs (synovium-derived MSCs,SMSCs)与BMSCs凋亡,探讨SMSCs的抗凋亡能力.方法 取患者自愿捐赠的滑膜组织及骨髓,分别采用组织贴壁法和密度梯度离心法分离培养SMSCs和BMSCs并传代,取第3～5代细胞行细胞免疫表型及三系分化鉴定后进行实验.实验分为4组,其中SMSCs、BMSCs凋亡诱导组(SMSCs、BMSCs实验组)用20 ng/mL TNF-α和10 μg/mL放线菌酮对细胞进行凋亡诱导,其对应对照组以正常培养基培养.倒置相差显微镜下观察凋亡诱导细胞形态变化;培养24 h取各组细胞,采用细胞计数试剂盒8及流式细胞术检测细胞存活率及凋亡率,Western blot法检测细胞半胱氨酶天冬氨酶蛋白酶降解产物8、3(Cleaved Caspase-8、3)的表达.结果 经细胞表型及三系分化鉴定培养获得的细胞均符合MSCs鉴定标准.倒置相差显微镜观察示,随凋亡诱导培养时间延长,两实验组细胞形态及生长均较对应的对照组差.培养24 h,两对照组细胞存活率均为100％,未见细胞凋亡;SMSCs、BMSCs实验组细胞存活率分别降至60.13％±8.63％及46.55％±10.54％,均显著低于对照组(P＜0.05),SMSCs实验组细胞存活率显著高于BMSCs实验组(t=3.152,P=0.006).SMSCs和BMSCs对照组细胞凋亡率分别为1.12％±0.24％和1.35％±0.31％,两实验组分别增高至36.54％±8.63％及53.77％±11.52％,均显著高于对照组(P＜0.05),且SMSCs实验组细胞凋亡率显著低于BMSCs实验组(t=3.785,P=0.00l).两对照组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白几乎不表达,且SMSCs实验组和BMSCs组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白明显高表达;其中BMSCs实验组明显高于SMSCs实验组(t=13.870,P=0.000;t=7.309,P=0.000).结论 经TNF-α诱导培养,SMSCs凋亡明显少于BMSCs,具有更强的抗凋亡能力.
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TGF-β3、BMP-2及地塞米松诱导兔滑膜MSCs成软骨分化的研究
目的 探讨TGF-β3、BMP-2及地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导兔滑膜MSCs (synovial MSCs,SMSCs)成软骨分化的作用. 方法 取5只10～16月龄新西兰大白兔(体重1.8～2.5 kg)膝关节滑膜分离培养SMSCs,并行形态学观察、流式细胞仪检测细胞表面抗原及成脂、成骨诱导分化鉴定.采用PELLET培养系统,将聚丙烯管中的SMSCs团块分成8组,分别加入不同组合的细胞因子进行成软骨诱导培养.A组TGF-β3,B组BMP-2,C组DEX,D组TGF-β3+ BMP-2,E组TGF-β3+DEX,F组BMP-2+ DEX,G组TGF-β3+ BMP-2+ DEX,H组为对照组.通过比较各组软骨微球的直径、重量,蛋白聚糖(甲苯胺蓝染色)、Ⅱ型胶原(免疫组织化学染色)表达,以及软骨标志基因表达水平[实时定量RT-PCR (real time quantitative PCR,RT-qPCR)]来评价各组细胞因子诱导SMSCs成软骨能力大小,确定佳成软骨诱导细胞因子组合;并通过检测各组软骨微球DNA含量来评价软骨微球重量增加与细胞增殖的关系. 结果 经鉴定,成功从新西兰大白兔膝关节处滑膜分离获得SMSCs.A～F组诱导产生的软骨微球直径较小、重量较轻,Ⅱ型胶原及蛋白聚糖合成量亦较低;而G组诱导产生的软骨微球直径大,重量重,蛋白聚糖及Ⅱ型胶原合成量亦多,均显著高于A～F组(P＜0.05);RT-qPCR结果显示,G组软骨相关基因(SOX-9、聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、BMP受体Ⅱ)的相对表达量显著高于其余各组(P＜0.01).各组软骨微球DNA含量随时间延长不断降低(7d降低约70％,14 d降低约80％,21d降低约88％). 结论 SMSCs在TGF-β3、BMP-2及DEX三者联合诱导条件下成软骨分化能力强;软骨微球重量的增加由细胞外基质合成增多导致,而不是由细胞增殖引起.
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腺病毒介导BMP-2/7共表达转染兔滑膜MSCs体外向纤维软骨样细胞分化的研究
目的 通过使用腺病毒介导BMP-2/7共表达载体转染兔滑膜MSCs (synovial-derived MSCs,SMSCs),观察其在体外向纤维软骨样细胞分化的可行性.方法 取3月龄新西兰大白兔6只,雌雄不限,体重(2.1±0.3)kg；取滑膜组织分离纯化SMSCs后,进行形态学观察及免疫细胞荧光染色、流式细胞仪、细胞周期鉴定,并检测其成脂、成骨、成软骨多向分化潜能.同时包装pAdTrack-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-BMP-7腺病毒载体,转染SMSCs后进行增殖动力学、核型分析、流式细胞仪检测细胞DNA含量、致瘤性分析等安全性鉴定.体外在不完全成软骨培养基中培养,观察其分化状态,并行RT-PCR检测、免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色检测.结果 从兔滑膜组织中分离出的SMSCs,其细胞形态、表面标记、多向分化潜能等均符合MSCs的特点.pAdTrack-BMP-2-IRES-BMP-7转染SMSCs的转染率约为70％.安全性鉴定结果显示转染后的SMSCs倍增时间、染色体数目及DNA含量均正常,且无致瘤性.体外不完全成软骨培养基诱导培养21d后,RT-PCR检测示SMSCs的Ⅰ、Ⅱ型胶原表达明显增加,以Ⅱ型胶原为主；软骨分化信号分子RhoA与Sox-9的表达经诱导后也明显增加.免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色结果亦显示转染后的SMSCs向纤维软骨样细胞分化.结论 使用腺病毒载体安全有效,可在体外定向诱导兔SMSCs向纤维软骨样细胞分化.
