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可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达
目的 构建可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体,并研究hBMP-2在人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可诱导性表达.方法 以pcDNA-hBMP-2为模板,通过PCR反应获取hBMP-2,运用GATEWAY技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EFIA-反向反式激活因子(reverse transactivator,rtTA),通过PCR鉴定重组慢病毒载体构建.将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT细胞,包装成能表达hBMP-2的可控性慢病毒,并测定病毒滴度.用病毒转染HUMSCs,使用强力霉素进行诱导,分别在相同诱导时间(48 h)不同诱导浓度(0、10、100 ng/mL,1、10、100μg/mL)及不同诱导时间(12、24、48、72 h)相同诱导浓度(10μg/mL)两种情况下用ELISA法测定hBMP-2的表达情况.对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况.结果 成功构建了携带hBMP-2的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA,并获得相应的病毒,病毒滴度分别为3.5×108TU/mL和9.5×107TU/mL;病毒转染HUMSCs后,HUMSCs可通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2.在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/mL时诱导表达强;而在相同诱导浓度下,hBMP-2的表达在诱导48 h达峰值.HUMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示胞浆中有大量红色的钙化基质沉积.结论 通过GATEWAY技术可以建立携带hBMP-2目的 基冈的可控性慢病毒载体,为进一步研究hBMP-2诱导HUMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路.
