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鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌的影响
目的 观察鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞的增殖和软骨细胞分泌Ⅱ型胶原是否有协同作用.方法 分离培养原代兔软骨细胞,用第3代细胞为模型,实验分为未转染组、腺病毒-绿色荧光蛋白(Ad-GFP)组、Ad-hBMP2-GFP组、鹿瓜多肽+Ad-hBMP2-GFP组,培养48 h后.RT-PCR检测hBMP-2mRNA的表达,流式细胞仪检测软骨细胞的周期.培养48、72 h后.MTT法检测软骨细胞的增殖,Western印迹检测hBMP-2蛋白和Ⅱ型胶原的表达.结果 培养48 h后,Ad-hBMP2-GFP组和鹿瓜多肽+Ad-hBMP2-GFP组hBMP-2mRNA呈阳性,而未转染组、Ad-GFP组表达呈阴性;与未转染组、Ad-GFP组、Ad-hBMP2-GFP组比较,鹿瓜多肽+hBMP-2基因组能使软骨细胞S-G2/M期细胞比例增加,软骨细胞数量增加(P<0.05),软骨细胞hBMP-2蛋白表达和Ⅱ型胶原分泌增加(P<0.01);培养48与72 h比较,鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌无显著性差异(P>0.05).结论 鹿瓜多肽能促进hBMP-2基因在软骨细胞中合成hBMP-2蛋白,鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞增殖和分泌Ⅱ型胶原的功能有协同作用.
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BMSCs胶原刮膜对松质骨缺损的修复
目的研究成骨蛋白-2(hBMP-2)基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)胶原刮膜对兔股骨髁松质骨缺损的修复能力.方法应用影像学、组织学、形态计量学和生物力学等方法,观察未经诱导、OS液诱导和hBMP-2基因转染BMSCs胶原刮膜植入兔股骨髁部直径6 mm、深12 mm松质骨缺损后的修复情况.结果未经处理的兔股骨髁缺损不能自行愈合; 细胞刮膜植入对股骨髁松质骨缺损的修复能力,在8和12周时hBMP基因转染BMSCs组＞OS液诱导BMSCs组＞未诱导BMSCs组(P<0.05),12周时hBMP基因转染BMSCs组的骨缺损区生物力学强度接近正常松质骨.结论hBMP基因转染BMSCs胶原刮膜是治疗大块松质骨缺损的理想修复材料.
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可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达
目的 构建可诱导表达hBMP-2的慢病毒载体,并研究hBMP-2在人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSCs)中的可诱导性表达.方法 以pcDNA-hBMP-2为模板,通过PCR反应获取hBMP-2,运用GATEWAY技术构建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EFIA-反向反式激活因子(reverse transactivator,rtTA),通过PCR鉴定重组慢病毒载体构建.将重组慢病毒与辅助质粒共同转染293FT细胞,包装成能表达hBMP-2的可控性慢病毒,并测定病毒滴度.用病毒转染HUMSCs,使用强力霉素进行诱导,分别在相同诱导时间(48 h)不同诱导浓度(0、10、100 ng/mL,1、10、100μg/mL)及不同诱导时间(12、24、48、72 h)相同诱导浓度(10μg/mL)两种情况下用ELISA法测定hBMP-2的表达情况.对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况.结果 成功构建了携带hBMP-2的可控性慢病毒载体pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA,并获得相应的病毒,病毒滴度分别为3.5×108TU/mL和9.5×107TU/mL;病毒转染HUMSCs后,HUMSCs可通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2.在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/mL时诱导表达强;而在相同诱导浓度下,hBMP-2的表达在诱导48 h达峰值.HUMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示胞浆中有大量红色的钙化基质沉积.结论 通过GATEWAY技术可以建立携带hBMP-2目的 基冈的可控性慢病毒载体,为进一步研究hBMP-2诱导HUMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路.
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脂质体介导的重组质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165体外转染对hRMSCs成骨能力的影响
目的 探讨重组质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165体外转染对hBMSCs成骨诱导分化的影响.方法 构建hBMP-2和hVEGF165真核共表达载体.取健康成人自愿捐献的骨髓分离培养hBMSCs,采用阳离子脂质体将构建的质粒plRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165和空质粒载体(pIRES-neo)转染至hBMSCs,作为A、B、C、D组;另取相同数量的未转染细胞作为对照组(E组).培养4周,采用RT-PCR检测hBMP-2、hVEGF165以及骨钙mRNA表达,Western blot检测细胞hBMP-2和hVEGF165表达,定量检测ALP活性,免疫组织化学方法检测Col Ⅰ表达.结果 与E组比较,A组hBMSCs高表达hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨钙素,B组大量表达骨钙素及Col Ⅰ,C组高表达hVEGF165而B组hVEGF165及C组hBMP-2和Col Ⅰ的表达与D、E组相似,呈阴性或仅有痕量表达.A、B、C、D及E组ALP活性分别为0.91±0.03、0.90±0.02、0.64±0.03、0.67±0.01、0.66±0.02,A、B组与E组比较差异有统计学意义(P＜0.05),C、D、E组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒通过阳离子脂质体能成功转染hBMSCs,外源性hBMP-2和hVEGF165基因在转染细胞中能持续表达,并能增强hBMSCs的成骨能力.
