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hVEGF165和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达
目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达.方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0.对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定.结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达.结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础.
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加味丹参饮含药血清对hVEGF165转染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影响
目的 探讨加味丹参饮含药血清诱导血管内皮生长因子165(hVEGF165)转染后BMSCs移植IRI大鼠的心肌血管新生的影响. 方法 构建hVEGF165转染BMSCs,将hVEGF165转染后PⅢ/Ⅳ BMSCs分别加入加味丹参饮含药血清和空白血清,体外诱导48 h.建立IRI大鼠模型,将实验大鼠分为4组,A组:假手术组;B组:IRI组;C组:hVEGF165转染组;D组:hVEGF165转染+加味丹参饮含药血清组.移植第7天,HE染色观察心肌组织形态学变化并做微血管计数. 结果 移植7d后,与A组相比,B组心肌微血管有一定再生,C组及D组与B组相比,微血管数上升明显,差异具有统计学意义(P＜0.05);D组与C组相比,微血管数上升,差异具有统计学意义(P＜0.05). 结论 IRI大鼠模型在移植hVEGF165转染BMSCs后,新生血管增多,加味丹参饮含药血清和hVEGF165转染联合应用效果更佳.
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脂质体介导的重组质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165体外转染对hRMSCs成骨能力的影响
目的 探讨重组质粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165体外转染对hBMSCs成骨诱导分化的影响.方法 构建hBMP-2和hVEGF165真核共表达载体.取健康成人自愿捐献的骨髓分离培养hBMSCs,采用阳离子脂质体将构建的质粒plRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165和空质粒载体(pIRES-neo)转染至hBMSCs,作为A、B、C、D组;另取相同数量的未转染细胞作为对照组(E组).培养4周,采用RT-PCR检测hBMP-2、hVEGF165以及骨钙mRNA表达,Western blot检测细胞hBMP-2和hVEGF165表达,定量检测ALP活性,免疫组织化学方法检测Col Ⅰ表达.结果 与E组比较,A组hBMSCs高表达hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨钙素,B组大量表达骨钙素及Col Ⅰ,C组高表达hVEGF165而B组hVEGF165及C组hBMP-2和Col Ⅰ的表达与D、E组相似,呈阴性或仅有痕量表达.A、B、C、D及E组ALP活性分别为0.91±0.03、0.90±0.02、0.64±0.03、0.67±0.01、0.66±0.02,A、B组与E组比较差异有统计学意义(P＜0.05),C、D、E组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒通过阳离子脂质体能成功转染hBMSCs,外源性hBMP-2和hVEGF165基因在转染细胞中能持续表达,并能增强hBMSCs的成骨能力.
