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异种移植抗原α-gal介导人血清杀伤A549细胞的实验研究
背景与目的 人体α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3 Galactosyltransferase,α-1,3GT)基因功能失活而不表达α-半乳糖基(α-galactosyl,α-gal)表位,但天然存在着大量抗α-gal抗体,异种器官移植研究结果提示,在人肿瘤细胞上重新表达异种移植抗原α-gal,可能诱发类似于宿主抗移植物超急性排斥反应的抗肿瘤效应.本研究通过基因导人手段,建立稳定表达异种移植抗原α-gal的转基因人肺癌细胞系,探讨α-gal介导的人血清抗肿瘤的可能性及其机制方法 将前期成功构建的α-1,3GT基因真核表达质粒pEGFP-N 1-GT瞬时转染人肺腺癌细胞A549,筛选并建立稳定的转基因细胞系A549-GT.MTT增殖实验和显微镜观察转基因细胞生物学特性变化;RT-PCR检测A549-GT中α-1,3GT基因mRNA表达;荧光素标记的凝集素(FITC-BS-IB4 lectin)染色检测α-1,3GT在肿瘤细胞表面合成α-gal的能力;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人细胞共培养,检验α-1,3GT基因的稳定性和酶活性的稳定性;人血清结合实验检测A549-GT与IgM和补体C3结合情况.结果 RT-PCR检测到转基因细胞系A549-GT中有α-1,3GT mRNA表达.荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示:A549-GT能够长期稳定表达异种移植抗原α-gal表位;A549-GT与其亲本细胞在生长形态及增殖速度上无明显差异;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人胚肺成纤维细胞MRC-5共培养均不能使MRC-5获得α-gal合成能力;经人血清处理后,荧光免疫实验观察到转基因细胞系A549-GT能与血清抗体IgM结合并诱导补体C3结合.结论 异种移植抗原α-gal在肿瘤细胞上的重新表达,可能通过补体依赖的细胞毒机制,介导类似于异种器官移植排斥反应的抗肿瘤效应.
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稳定表达猪α1,3-半乳糖苷基转移酶基因的人肺腺癌细胞系的建立和鉴定
目的 建立稳定表达中国近交系版纳微型猪(BMI)α1,3-半乳糖苷基转移酶基因(α1,3-GT)和α-半乳糖基(Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R,α-gal)的人肺癌细胞株,为进一步研究人体血清经补体依赖的细胞毒性作用杀伤表达异种移植抗原的肿瘤细胞提供细胞模型.方法 将含有版纳微型猪α1,3-GT基因的pEGFP-CMV-GT质粒经脂质体法体外转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选稳定表达的细胞克隆并扩增,命名为A549-GT.用RT-PCR检测A549-GT中α1,3-GT基因的mRNA表达,荧光显微镜和流式细胞仪检测α1,3-GT在细胞膜表面合成α-gal表位的能力以及A549-GT与人血清中IgM和补体C3结合情况.检测转染细胞形态学、生长增殖能力以及裸鼠成瘤性等生物学特征.结果 经G418反复筛选获得了稳定转染α1,3-GT基因的A549-GT的细胞系,该细胞中检测到α1,3-GT mRNA和α-gal表达.A549-GT传代至今已2年,α-gal表达的阳性细胞达80.1%±3.2%.A549-GT细胞能与人血清中的IgM结合并有补体C3沉积.其生物学特性与亲代A549细胞相比未发生变化.结论 成功获得持续稳定表达猪α1,3-GT和α-gal的细胞系A549-GT,为该基因在后续肿瘤免疫治疗中的研究提供有用的细胞研究模型.
