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显性阴性分子文献资料
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去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达
目的:构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株,为利用去C-末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础.方法:用限制性内切酶从质粒PcJak3(△C)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PL Jak3(△C),通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G418筛选抗性细胞,转染的包装细胞包装出病毒粒子,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G418筛选抗性克隆,检测出病毒滴度;经免疫沉淀(IP)、SDS-PAGE电泳、Western blotting检测NIH3T3细胞中Jak3(△C)的表达情况.结果:①重组逆转录病毒载体PL Jak3(△C)酶切和DNA检序均表明已含有2796bp的Jak3(△C)基因;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段;③病毒滴度为1.2～2.0×104CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(△C)蛋白,其分子量为107KD.结论:我们已成功构建了去C-末端Jak3重组逆转录病毒载体PL Jak3(△C),并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆,为利用Jak3(△C)对白血病进行基因治疗研究奠定了实验基础.
