胶质瘤的白细胞介素-4免疫基因治疗实验研究

胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤.本研究通过逆转录病毒载体将白细胞介素-4(IL-4)基因导入逆转录病毒包装细胞,注入到脑内荷瘤大鼠肿瘤组织中,观察其对胶质瘤的治疗作用.

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及病毒包装细胞系的建立

人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验,同时,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中广泛使用的基因转移方法[1-3].迄今所掌握的研究资料表明,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应.因此,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至该载体,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.

反义寡核苷酸减弱转染p16基因对包装细胞生长的抑制

目的:应用p16(MTS1)反义寡核苷酸抑制转染p16逆转录病毒载体后外源性p16基因的表达,减弱p16表达对包装细胞的生长抑制作用.方法:合成p16 cDNA起始密码子区的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸,加入筛选的转染p16逆转录病毒载体的包装细胞培养液中,记录各孔中出现细胞克隆的时间和数量,测量各形成细胞克隆的病毒上清滴度.Western blot 检测反义寡核苷酸对外源性P16蛋白表达的影响.MTT法检测加入反义寡核苷酸后对转染的包装细胞生长的影响.结果:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达.加入反义寡核苷酸的包装细胞形成细胞克隆的时间提前,克隆数量和滴度都高于对照组.结论:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达,促进p16逆转录病毒载体转染的包装细胞的生长并提高病毒滴度.

人胰岛素原基因的包装及增殖

目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建mIL-12重组逆转录病毒载体.方法:将mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒.结果:重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达.结论:包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制.

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织(含有活化的淋巴细胞)提取总RNA,经逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)获得小鼠IL-23 cDNA.经DNA测序分析,证实该片段与GeneBank记载的IL-23 cDNA序列一致.将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体,并转染大肠杆菌DH5α中扩增,再感染ф2(ecotropic)和PA317(amphotropic)两种包装细胞,经G418筛选后获得表达IL-23分子的PA317阳性细胞克隆.通过用PCR、RT-PCR及Northern blot技术检测目的基因表达,结果表明,成功地将鼠IL-23 cDNA插入逆转录病毒载体,经转染两种包装细胞产生了高表达IL-23的PA317细胞克隆.该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞,为制备肿瘤疫苗奠定了基础.

293包装细胞产生重组逆转录病毒的基因转染研究/脊髓半切损伤模型的建立/新生大鼠大脑皮质O-2A祖细胞的体外诱导分化

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的:研究肿瘤的自杀基因疗法,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK. 方法:应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G418筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况. 结果:逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G418后筛选得到阳性克隆细胞,命名为PA317/TK. PCR检测 PA317/TK细胞出现一特异性404 bp阳性条带,而 PA317细胞没有扩增出相应条带 .PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起,其周围有许多呈团状的病毒颗粒.证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中. 结论:成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞.

抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体的包装及增殖

在我国,恶性淋巴瘤在儿童和青年中所占比例较高[1].大部分恶性B细胞淋巴瘤呈CD20高表达状态,利妥昔单抗是针对CD20抗原的单克隆抗体药物,能准确地识别并与之结合,并通过人体免疫清除这些肿瘤细胞[2,3],然而该药物单独治疗B细胞淋巴瘤的有效率仅达到48%[4].

逆转录病毒载体包装细胞的培养及包装过程

目的 为了获得通用型逆转录病毒载体.方法 本实验在成功构建复制缺陷型逆转录病毒载体的基础上,对复制缺陷型逆转录病毒载体的包装细胞进行培养,然后用脂质体介导法将载体转染包装细胞.结果 经病毒滴度测定可知包装成功.结论 获得了复制缺陷型逆转录病毒载体.

tPA基因逆转录病毒载体构建及纯包装细胞系培育

目的 构建含人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因逆转录病毒载体及产高滴度病毒的纯包装细胞系.方法 PCR技术扩增目的基因tPA,定向克隆人逆转录病毒载体pLEGFP-N1中,测序鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-tPA,将其转入包装细胞PT67,培育全EGFP纯包装细胞系;测定病毒滴度.结果 证实pLEGFP-N1-tPA中含有tPA基因.转染有PLEGFP-N1-tPA的纯PT67细胞产病毒滴度为1×107 CFU/ml.结论 成功构建了pLEGFP-N1-tPA载体,并培育了产高滴度病毒纯包装细胞系.

逆转录病毒介导的反义C-MYC的抗小鼠L6565白血病作用

目的和方法:L6565白血病是我国特有的T-S-Z淋巴瘤/白血病系统中的实验系统的瘤株之一,经检测c-myc基因高表达.本文针对c-myc基因构建一个含有小鼠反义c-myc基因片段的逆转录表达载体pGAM,用磷酸钙沉淀法将pGAM导入表达包装细胞PA317,经筛选获得病毒效价5×105 cfu/mL的病毒包装细胞,利用pGAM病毒成功的感染了L6565细胞,得到了G418抗性细胞L6565-as,经PCR分析病毒载体序列稳定地整合到PA317和L6565-as中,能够长期表达.结果:L6565-as和对照细胞光镜下形态均为圆形或椭圆形,细胞大小不一,但L6565as细胞核浆比例比对照细胞小.生长曲线和MTT法显示,L6565-as生长与对照细胞相比,生长明显受到抑制.流式细胞仪检测细胞周期:L6565as细胞G0-G1为45%,PGNsC对照和空白对照细胞分别为26%和29%.软琼脂克隆发现L6565as细胞形成克隆数量明显减少,为30个克隆/5000个细胞,空载病毒和空白对照分别为103和106个克隆/5000个细胞,二者有显著差异(P＜0.001).免疫组化检测L6565as细胞c-myc蛋白表达为弱阳性(+),而对照细胞为强阳性(+++).Northern blot检测发现L6565as细胞c-myc mRNA表达比对照减少.结论:反义c-myc基因抑制了L6565白血病细胞的DNA合成,减缓了细胞的生长速度,并且使细胞恶性程度降低.本研究同时也是对我国T-S-Z系统白血病研究的一种深入.

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株,为利用去C-末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础.方法:用限制性内切酶从质粒PcJak3(△C)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PL Jak3(△C),通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G418筛选抗性细胞,转染的包装细胞包装出病毒粒子,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G418筛选抗性克隆,检测出病毒滴度;经免疫沉淀(IP)、SDS-PAGE电泳、Western blotting检测NIH3T3细胞中Jak3(△C)的表达情况.结果:①重组逆转录病毒载体PL Jak3(△C)酶切和DNA检序均表明已含有2796bp的Jak3(△C)基因;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段;③病毒滴度为1.2～2.0×104CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(△C)蛋白,其分子量为107KD.结论:我们已成功构建了去C-末端Jak3重组逆转录病毒载体PL Jak3(△C),并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆,为利用Jak3(△C)对白血病进行基因治疗研究奠定了实验基础.

逆转录病毒载体介导的基因治疗中可复制逆病毒的检测

目的:探讨逆转录病毒载体介导的基因治疗中,可复制逆转录病毒(RCR)的检测方法,为其在应用中的安全性奠定基础.方法:构建含抗HIV-1整合酶单链抗体基因的逆转录病毒表达载体(pSLXCMV/IN-sFv),应用3T3放大实验继S+/L-试验对其包装细胞(PA317/IN-sFv)上清中RCR进行了检测,并以野生型4070A病毒为阳性对照.结果:含IN-sFv的包装细胞上清中RCR呈阴性,不同稀释度的阳性对照中,可见明确的灶状细胞并与已知病毒滴度相符.结论:该结果进一步证实了上述RCR检测系统的可靠性,同时也是我们以sFv为目的基因进行逆转录病毒载体介导基因治疗临床试验的可靠指标.

重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素

目的:探讨产生重组逆转录病毒包装及其病毒滴度(以cfu表示)的影响因素.方法:用逆转录病毒载体pMNS-TK-M,以脂质体法转染包装细胞PA317细胞,挑选抗性集落(PA317/pMNS-TK-M)扩大培养后,进行PA317/pMNS-TK-M细胞接种密度、培养温度(37℃,32℃)、纯化方法等对其培养上清中重组病毒cfu影响的比较性研究.结果:包装细胞的密度是影响cfu的关键因素;降低培养温度需延长培养时间方可提高cfu滴度.结论:该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的基因治疗实验研究提供重要的参考依据.

产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素

目的探讨产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及其病毒滴度(以cfu表示)的影响因素. 方法用逆转录病毒载体pSLXCMV，以磷酸钙共沉淀法转染PA317包装细胞，挑选抗性集落(PA317/pSLXCMV)扩大培养后,进行PA317/pSLXCMV细胞接种密度、培养温度(37℃,32℃)、纯化方法等对其培养上清中重组病毒cfu影响的比较性研究. 结果包装细胞的密度是影响cfu滴度的关键因素；降低培养温度需延长培养时间方可提高cfu滴度；对比离心纯化与过滤纯化，并未发现两者之间的差异. 结论该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的ex vivo基因治疗实验研究提供重要参考指标.