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狂犬病疫苗生产中病毒滴度与疫苗效力关系的实验研究
探讨在原代地鼠肾细胞组织培养的狂犬病疫苗(PHKCV)工业化生产中,对病毒滴度与疫苗效力进行测定,并对数据进行分析.结果,现行生产工艺下,病毒滴度与疫苗效力为线性正相关.
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芪倍液体外抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的实验研究
目的 研究芪倍液体外抗Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)的作用机理.方法 利用体外细胞培养技术,采用微量细胞病变抑制法来研究中药各浓度组的抑制病毒增殖作用、直接杀伤病毒作用,以病毒滴度和抑制病毒指数为指标.结果 ①抑制病毒增殖实验:芪倍液1.63、0.81、0.41 mg/mL浓度组的病毒滴度与病毒对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),抑病毒指数>2;⑦直接杀伤病毒实验:芪倍液1.63 mg/mL-8 h组、1.63 mg/mL-24 h组,0.81 mg/mL-24 h组的病毒滴度与病毒对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组的病毒滴度与病毒对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 芪倍液具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的作用.
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荆芥挥发油及其主要成分抗流感病毒作用与机制研究
目的:体内、体外实验观察荆芥挥发油及主要成分薄荷酮、胡薄荷酮的抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1 N1)作用及其Toll样受体/干扰素(toll-like receptor/interferon,TLR/IFN)信号通路机制.方法:制备流感病毒性肺炎模型小鼠,以预防和治疗方式给药,测定模型动物肺组织病毒滴度以评价药物体内抗H1N1效应.ELISA法观察药物对模型小鼠血清干扰素-α(interferon-alpha,IFN-a),干扰素-β(interferon-beta,IFN-β),白介素-2(interleukin-2,IL-2),白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)水平的影响及病毒感染狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)上清液中IFN-β分泌水平的影响.实时荧光定量RT-PCR法观察药物对病毒感染MDCK细胞白介素1受体相关激酶-4(IL-1R-associated kinase-4,IRAK4)与Toll样受体3(toll-like receptor-3,TLR3) mRNA表达水平的影响.结果:体内实验表明,荆芥挥发油0.226 mg·kg-1、薄荷酮0.5 mg·kg-1及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1治疗方式给药明显降低感染小鼠肺组织病毒滴度；荆芥挥发油0.226 mg·kg-明显升高感染小鼠血清IFN-α,IL-2含量；薄荷酮0.5 mg· kg-1显著提高血清IFN-β含量.薄荷酮0.5mg-kg-1、胡薄荷酮0.19mg·kg-1明显降低病毒感染小鼠血清IL-6含量.荆芥挥发油0.452,0.226 mg·kg-1及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1明显降低模型小鼠血清TNF-α含量.体外实验显示,荆芥挥发油0.1g.L-1、胡薄荷酮0.1g·L-1显著升高感染细胞上清液中IFN-β含量,并使细胞IRAK4 mRNA表达水平显著升高；薄荷酮0.25 g· L-1使感染细胞IRAK4mRNA表达显著增强,但明显降低TLR3 mRNA表达.结论:荆芥挥发油、薄荷酮及胡薄荷酮治疗方式给药能显著降低病毒感染小鼠肺组织病毒滴度,显示出体内抗病毒作用,但预防给药效果不明显.体内抗病毒感染机制与提高感染小鼠干扰素(IFN-α,IFN-β),IL-2水平,抑制IL-6,TNF-α分泌有关；细胞模型结果提示药物通过TLR3和TLR7信号通路影响IFN-β的表达.
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扶正除疫颗粒抗甲型H1N1流感病毒感染作用评价
目的 评价扶正除疫颗粒抗甲型H1N1流感病毒感染的效果.方法 将112只小鼠随机分为正常对照组、病毒模型组、达菲对照组、扶正除疫组,每组28只.正常对照组和病毒模型组以生理盐水灌胃,每次0.4ml/只;达菲对照组以达菲水溶液0.025 g/ (kg·d)灌胃,扶正除疫组以扶正除疫颗粒水溶液12g/(kg·d)灌胃,均每日1次,共连续灌胃7天.给药第3天,除正常对照组外其余3组以H1N1亚型季节性流感病毒鼠肺适应株FM 1-6-E2滴鼻造模,攻毒剂量为5LD50,50 μ1/只,造模后1h各组继续给药.从攻毒后感染之日起,每组取10只,连续观察14天,观察小鼠死亡情况;各组余18只于攻毒后3天、6天、9天计算肺指数,检测病毒滴度,观察肺组织病理变化.结果 病毒模型组10只小鼠全部死亡;达菲对照组和扶正除疫组死亡率均为0.攻毒后第9天,达菲对照组、扶正除疫组与病毒模型组比较,肺指数明显降低(P＜0.05或P＜0.01);攻毒后第3天、6天,达菲对照组、扶正除疫组与病毒模型组比较,肺组织病毒滴定度明显降低(P ＜0.05或P＜0.01).达菲对照组与扶正除疫组小鼠肺脏病理变化较为轻微,炎症反应程度明显弱于病毒模型组.结论 扶正除疫颗粒对小鼠感染甲型H1N1流感病毒后具有死亡保护作用,对流感病毒在宿主体内复制有抑制作用.
关键词： 扶正除疫颗粒 甲型H1N1流感病毒 死亡率 肺指数 病毒滴度 -
胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建
目的构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因重组逆转录病毒,为将IGF-1基因应用于神经系统疾病的治疗打下基础.方法质粒pcDNA3.1-IGF-1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pLXSN-IGF-1,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染pLXSN-IGF-1至包装细胞pA317,检测培养上清病毒滴度.结果重组真核基因表达载体pLXSN-IGF-1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,得到了400 bp和6.0 kb两条带;以重组体为模板进行PCR检测,400 bp的目的基因片段呈阳性;重组体测序结果与预期结果完全一致;建立了细胞系PA317-IGF-1,其培养上清平均病毒滴度为6.5×105 CFU/ml.结论成功构建了IGF-1基因重组逆转录病毒.
关键词： 胰岛素样生长因子-1 逆转录病毒载体 病毒滴度 基因重组 质粒 -
使用新型稳定剂的水痘减毒活疫苗的分装冻干工艺改进
目的 研究使用新型无明胶稳定剂生产水痘减毒活疫苗(Varicella attenuated live vaccine,VarV)的分装冻干工艺对于产品品质的影响.方法 采用柱塞式分装泵灌封机对VarV半成品进行分装,对冻干机进行板层温度均匀性测试,按照实验设计的不同冻干程序进行冻干,对冻干疫苗的水分、外观、病毒滴度等指标进行检定.结果 柱塞式分装泵灌封后的VarV半成品较均一、稳定;板层温度较均匀;在保证产品品质的前提下,合适的干燥温度可减少能耗开支,掺气可缩短冻干周期.结论 改进后的冻干工艺可以提高VarV质量,减少能耗.
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麻疹减毒活疫苗市场监督检验质量分析和评价
目的 为保障麻疹减毒活疫苗(Measles Attenuated Live Vaccin,MV)的安全性和有效性,通过对市场流通的MV进行评价性抽验,以了解流通环节和使用中的MV质量状况.方法 从24个省(自治区、直辖市)、设区的市(地区、州、盟)、县(区、市、旗)级疾病预防控制中心(CDC)以及基层使用单位抽取MV样品,通过检测其病毒滴度,评价和分析MV在流通中的质量状况.结果 在各级CDC及基层使用单位抽取的54批MV样品,其病毒滴度均符合2005年版<中国药典>三部的规定要求.在市场流通的MV的病毒滴度与其出厂时的病毒滴度比较,病毒滴度平均下降(0.2 lg±0.3).结论 MV具有较好的稳定性,其质量均合2005年版<中国药典>三部的规定要求,同时也表明疫苗运输和保藏的冷链系统较好.
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结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立
目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性；应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析；采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证；采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差；经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.
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免疫荧光法检测杆状病毒滴度的建立及验证
目的 建立并优化生产用重组杆状病毒滴度间接免疫荧光检测方法,并进行初步验证.方法 将96孔板贴壁培养的SF9细胞,接种杆状病毒溶液共孵育一定时间后间接免疫荧光法显色.通过对细胞使用浓度、孵育时间及优化显色处理条件(固定液、封闭液、抗体种类及使用条件),建立杆状病毒滴度间接免疫荧光检测方法,进行特异性、准确性、重复性和中间精密度验证,并与杆状病毒滴度酶联检测试剂盒检测结果进行比较.结果 细胞使用浓度为0.6×106个/ml、共孵育时间为3d;显色条件优化后确定了冰冻甲醛-丙酮溶液为适固定溶液和5％的山羊血清封闭液,一抗和二抗稀释比例均为1:200、37℃温育1 h时显色效果佳.用该方法检测不同样品,仅杆状病毒组出现特异性荧光斑点.本方法与试剂盒酶联法检测结果趋势相同,其线性相关系数R2=0.996,表明两种方法具有良好的正相关性;重复性及中间精密度验证结果的变异系数CV均<10％.结论 建立了重组杆状病毒滴度的间接免疫荧光检测方法,该方法具有良好的特异性、准确性、重复性和中间精密度,可用于生产中病毒滴度的检测.
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激肽释放酶腺相关病毒载体的构建及病毒滴度的测定
目的构建人组织激肽释放酶(HK)腺相关病毒载体,并检测其滴度.为HK的真核表达及其临床研究提供实验基础.方法从带有人HK基因的pBluescript Ⅱ KS质粒中扩增出HK-cDNA,并将HK-cDNA克隆到腺相关病毒载体pAAV-MCS中,构建pAAV-HK表达质粒.并将此表达质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、以及腺病毒辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组HK的腺相关病毒.以pAAV-LacZ和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,对报告基因LacZ用X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度.结果扩增出的cDNA片段经DNA测序终确定为HK-cDNA.通过LacZ测定HK重组腺相关病毒的滴度为6.2× 107个/ml.结论重组HK的腺相关病毒可以在HT-1080细胞中表达HK,本实验为今后研究HK的生物学活性及心血管病的基因治疗奠定了基础.
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水痘减毒活疫苗的稳定性研究
目的:考察水痘减毒活疫苗的稳定性.方法:疫苗在2～8℃放置30 - 36个月,检测病毒滴度、水分、牛血清蛋白残留量、无菌、外观等主要技术指标,并进行25℃6个月加速试验和37℃4周热稳定性试验.结果:各项检测结果均符合《中华人民共和国药典》及《水痘减毒活疫苗注册标准》要求.结论:本品质量稳定,可将有效期延长至2-8℃贮存24个月.
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轮状病毒LLR株在两种不同细胞中病毒滴度的比较
目的:通过轮状病毒LLR株在牛肾细胞和Vero细胞中培养效果的比较,为轮状疫苗的生产筛选佳的细胞基质和培养条件.方法:将轮状病毒LLR株按MOI 0.02分别接种牛肾细胞和Vero细胞,在相同培养条件下进行培养,每天观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对轮状病毒LLR株的敏感性.结果:牛肾细胞在感染轮状病毒LLR株后d3病毒滴度达到高,为6.8 lgCCID5o· mL-1；而Vero细胞在感染轮状病毒LLR株后d8病毒滴度达到高,为7.3 lgCCID50·mL-1.轮状病毒LLR株在牛肾细胞和Vero细胞上均能达到满意的病毒表达量.结论:轮状病毒LLR株在Vero细胞中培养能够达到理想的病毒表达量,利用Vero细胞培养轮状病毒LLR株,有利于提高疫苗的产量和质量.
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比较胰酶/EDTA两种消化液对携带水痘-带疱疹病毒的2BS消化效果分析
目的 比较胰酶和EDTA两种消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞冻融后的病毒滴度(VT).方法 分别配制两种浓度的胰酶和EDTA:0.125%、0.25%的胰酶,0.01%、0.02%的EDTA各1000 ml,按比例加入预先培养好的携带水痘-带疱疹病毒的等量2BS细胞中,消化后,用显微镜观察细胞形态,消化液离心、浓缩、冻融、检测并比较病毒滴度.结果 与0.125%、0.25%的胰酶、0.01%EDTA,0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合消化液相比,用0.02%的EDTA消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞,冻融后的病毒滴度提高了1.3~0.8个log值.结论 用0.2%EDTA消化液消化的含有水痘病毒的细胞获得的病毒滴度好.
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乙型脑炎减毒活疫苗贮存过程中VVM变色程度与滴度的相关性
为了考察VVM变色程度与滴度的相关性,为疫苗的冷链运输提供参考数据.抽取保留样品,通过37℃的加速试验检测VVM的OD差值和样品病毒滴度.结果显示,在37℃孵箱中放置时间越长,VVM的OD差值明显下降,滴度有下降,但不明显.证明VVM标签能监控疫苗的温度变化.乙型脑炎减毒活疫苗稳定性较好,VVM的OD差值与疫苗滴度有相关性.
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hIGF-1腺相关病毒质粒的构建、包装和滴度测定
目的:构建pAAV/hIGF-1载体,并测定pAAV/hIGF-1病毒粒子包装盒病毒滴度.方法:将hIGF-1基因克隆入pAAV腺病毒相关病毒载体,以HEK293包装细胞包装病毒颗粒,HT1080细胞检测病毒滴度.结果:获得插入方向正确的hIGF-1腺相关病毒载体,HEK293细胞包装得到了1012滴度的病毒上清.结论:成功构建了hIGF-1腺相关病毒载体,并且获得了较高滴度包装病毒颗粒.
关键词： hIGF-1 腺相关病毒载体(AAV) 病毒滴度 -
重组腺病毒TGF-β的扩增及病毒滴度检测
目的:探讨高效扩增腺病毒载体的方法.方法:用人胚胎肾细胞株扩增重组腺病毒,并测定病毒滴度.结果:扩增病毒滴度约为5×108pfu/mL.结论:用人胚胎肾293细胞株扩增重组腺病毒,在不进行任何浓缩时可达到较高病毒滴度,为腺病毒介导的基因转载提供了有效途径.
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口服脊髓灰质炎活疫苗糖丸的病毒滴度及其分析
对1994～1998年共5年间生产的口服脊髓灰质炎活疫苗糖丸的病毒滴度的检定结果进行质量分析.结果显示:近5年生产的口服脊髓灰质炎活疫苗糖丸中,其病毒滴度稳中有升,平均滴度由6.13logTCID50/人份上升到6.25logTCID50/人份;同时疫苗的热稳定性试验结果也在逐步提高,其病毒滴度的平均基础滴度与37℃48h平均滴度差值的平均值由0.87logTCID50/人份下降到0.63logTCID50/人份.
关键词： 口服脊髓灰质炎活疫苗糖丸 病毒滴度 热稳定性 -
克隆人血小板源性生长因子B基因构建腺相关病毒载体及其病毒滴度测定
目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒.方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存.②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框.聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定.③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化.④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度.结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入.②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6 h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒.24 h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应.48 h后细胞变形,逐渐从壁上脱落.72 h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色.③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1.结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础.
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大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
背景：研究表明，神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子，因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰，有可能将成体细胞转分化为神经细胞，为视神经再生治疗提供新策略。目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体，获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP，以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。方法：用 XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切；回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化至 DH5α感受态；提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体， PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染 HEK293细胞进行包装、扩增，采用 PCR 法对重组腺病毒进行鉴定， TCID50法测定病毒滴度，荧光显微镜观察病毒感染效率。结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定，证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确，PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带，TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含 ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功，获得的病毒具有高滴度，高效感染率，为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。
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人胰岛素原基因的包装及增殖
目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.
