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LRAP文献资料
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靶向人白细胞源性精氨酸氨肽酶基因shRNA重组腺病毒的构建
目的:构建靶向人白细胞源性精氨酸氨肽酶(LRAP)基因的shRNA重组腺病毒,有效抑制LRAP基因在人视网膜血管内皮细胞中的表达.方法:设计并合成3对靶向人LRAP基因shRNA的单链寡核苷酸,退火后克隆至腺病毒穿梭载体pRNAT-H1.1/Adeno得到3个重组穿梭质粒.将重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183-AD-1中进行同源重组形成腺病毒表达质粒,并在293a细胞中包装形成重组腺病毒颗粒.重组腺病毒经扩增和滴度测定后感染原代培养的人视网膜血管内皮细胞,应用荧光实时定量PCR测定LRAP mRNA的相对表达量,筛选得到沉默效率高的LRAP shRNA重组腺病毒,并应用Western blot法验证经RNA干扰后视网膜血管内皮细胞中LRAP的蛋白表达水平.结果:PCR、酶切和DNA测序证实LRAP shRNA重组穿梭质粒和表达质粒的插入序列正确.收获病毒后的PCR证实重组腺病毒颗粒包装成功.实时荧光定量PCR筛选得到具有大沉默效率的重组腺病毒,其沉默效率达到约79％.Western blot法证实经RNA干扰后,人视网膜血管内皮细胞中的LRAP蛋白水平显著降低.结论:成功构建了靶向人LRAP基因的shRNA重组腺病毒,可有效抑制人视网膜血管内皮细胞中LRAP基因的表达.
