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单链丝氨酸蛋白酶文献资料
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稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立
目的:构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶(scNS4A/NS3)的真核表达载体;建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆. 方法:根据文献报道设计扩增scNS4A/NS3编码基因的引物,从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA,RT-PCR方法扩增出scNS4A/NS3基因片段, BamHⅠ/HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-),转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pcDNA3.1(-)～scNS4A/NS3,经酶切鉴定及序列测定. 将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT-PCR,IFA,Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白. 结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-scNS4A/NS3;建立了稳定转染的HepG2细胞克隆,命名为scpHepG2. 结论:获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白,为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础.
