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泡球蚴Em18抗原基因的分段表达及抗原表位的初步分析
目的 构建截短的泡球蚴18(Em18)基因的原核表达质粒,获得高效表达、有生物活性的重组蛋白并对其进行初步鉴定.方法 采用DNAman软件设计引物,聚合酶链式反应(PCR)法扩增并构建截短的pET41a-Em18.4原核表达质粒,测序鉴定插入序列正确性.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导、表达和纯化rEm18.4-GST重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳及蛋白免疫印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测对其进行初步鉴定.结果 成功构建出截短的pET41a-Em18.4,SDS-PAGE检测表明rEm18.4-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为41 KDa处有表达条带.但蛋白免疫印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测结果显示rEm18.4-GST重组蛋白不能与AE患者阳性血清反应.结论 成功构建出截短的pET41a-Em18.4原核表达质粒并表达的rEm18.4-GST重组蛋白,但其缺乏抗原性,可能与Em18的空间构象有关.
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Em18.3重组蛋白的表达及其免疫诊断特性的研究
目的:在大肠杆菌中表达和纯化截短的泡球蚴rEm18.3抗原重组蛋白,对其免疫诊断特性进行鉴定.方法: IPTG诱导pET41a-Em18.3原核表达质粒,表达和纯化rEm18.3-GST重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blot法对其进行初步鉴定,ELISA法确定其免疫诊断特性.结果: rEm18.3-GST重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE电泳显示相对分子量为45 kDa.Western blot结果表明,rEm18.3-GST重组蛋白能被AE病人阳性血清识别.对56例多房棘球蚴病(AE)、88例细粒棘球蚴病(CE)、24例其他寄生虫病、24例其他疾病和24例健康者共236份血清进行ELISA检测结果显示,对AE血清诊断的敏感性为10.7%,特异性为99.4%,阳性预测值85.7%,阴性预测值78.1%.结论: rEm18.3-GST免疫诊断价值较低,Em18抗原重要的表位可能位于1-40位氨基酸.
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泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化方法的优化
目的:筛选和优化泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化的方法,为进一步筛选Em18抗原表位奠定基础.方法:原核表达pET41a-Em18重组质粒,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导、表达,获得rEm18-GST蛋白,采用不同的超声程序破碎大肠杆菌细胞,分别采用GST柱、His柱及两者结合方法,改变不同的平衡、洗涤和洗脱缓冲液浓度,纯化rEm18-GST蛋白.结果:(1) rEm18-GST蛋白在相对分子质量为50 kDa处有表达条带,蛋白表达量随诱导时间的延长而增加;(2)超声程序为工作1 s,间歇3 s,每个循环时程10 min,加入蛋白酶抑制剂,可降低目的蛋白的降解;(3)采用单纯His柱可获得回收量高、纯度高的rEm18-GST蛋白.结论:(1)对含有GST-tag和His-tag双重标签重组蛋白的纯化,应用His柱更有效,更经济;(2)建立和优化一套从大肠杆菌细胞中分离纯化重组Em18蛋白的有效方法.
