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应用ELISA测定睫状神经营养因子中卡那霉素残留量
目的:建立ELISA检测卡那霉素残留量的方法并进行方法学验证,用于重组技术产品的质量控制.方法:采用间接竞争ELISA方法,样本中残留的卡那霉素将和微孔板上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体,加入酶标二抗后,用3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物显色,样本吸光值与残留卡那霉素的含量成负相关,用酶标仪进行检测并用SOFT MAX分析软件进行分析.结果:ELISA方法测定卡那霉素残留量在0.5～40.5 ng·mL-1范围内线性良好,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,r2≥0.99;板内变异小于15%,板间变异小于20%,实验重复性好,加标回收率在80%～120%之间;该方法检测与庆大霉素、盐酸四环素、链霉素和氨苄西林药物未显示交叉反应.应用该法对1批睫状神经营养因子(CNTF)原液的卡那霉素残留量进行测定,结果表明,每人用剂量CNTF(100 μg)卡那霉素残留量小于0.5 ng.结论:该方法具有灵敏度高、操作简便、检测迅速等特点,可用于重组技术产品中卡那霉素残留量的检定.
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荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较
目的:对用于检测重组技术产品中残余DNA的荧光法及DNA杂交法进行比较性评价.方法:应用地高辛标记的DNA杂交法以及PicoGreen荧光法对3批重组人干扰素α2b中外源DNA残留量进行测定.结果:荧光法检测结果显示3批重组人干扰素α2b制品中DNA残留量分别为每人份剂量(0.695±0.021)ng、(0.664±0.021)ng、(0.916±0.017)ng,而用地高辛标记的DNA杂交实验由于阳性基因组DNA灵敏度偏低以至于结果无法判断.应用琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen荧光法测得由生产单位提供的阳性DNA浓度明显偏低,与标示量不符,这说明阳性DNA含量偏低是本次DNA杂交实验失败的主要原因.通过对该阳性DNA重新定量后冉进行DNA杂交检测,结果显示3批重组人干扰素α2b制品的DNA残留量均小于每人份剂量1 ng,该结果与PicoGreen荧光法相一致.结论:荧光法具有简便、快速,自动化程度高,不受工程菌种类限制,能够精确定量等特点,优于传统的DNA杂交法,更适于重组制品残余外源DNA含量的常规检定.
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对斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量的影响因素研究
目的:对斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中的6个影响因素进行评价.方法:对不同的样品稀释液,样品中是否含有蛋白,含蛋白样品是否采用蛋白酶K处理,采用不同方法预处理的模板DNA作为标记用模板,采用不同体积的离心管进行探针标记,分别采用不同的杂交温度,共计6个因素对检测结果的影响进行评价.结果:在使用随机标记的探针通过斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中:标准品和样品稀释中使用水进行稀释时结果可信度较高；样品中含有蛋白会降低检测的灵敏度；在含蛋白样品中加入蛋白酶K处理可以在一定程度上提高检测的灵敏度；使用超声处理的模板DNA作为探针标记的模板时,检测灵敏度较高,同时背景较低；探针标记过程中应采用0.2 mL薄壁PCR管作为容器以保证试验成功率；适的杂交温度为42℃左右.结论:在斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量中,采用水作为稀释液,对含蛋白样品使用蛋白酶K消化,标记用模板DNA使用超声处理,使用0.2 mL薄壁PCR管作为标记反应管和在42℃杂交时,结果的稳定性和灵敏度有较大提高.
