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地高辛标记炭疽杆菌DNA探针的研究
本文介绍了试用地高辛标记,将炭疽芽孢杆菌的PXD1和PXD2两质粒上分别扩增到290bp和288bp基因片断制成非放射性标记探针,利用菌落原位杂交方法进行检测,表明两探针的敏感性、特异性均良好,提示该两探针将能为基层工作提供更准确、快速的炭疽杆菌检验技术.
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地高辛标记的ZNF216 cRNA探针的制备及鉴定
制备地高辛标记的ZNF216 cRNA探针.将目的基因ZNF216重组到pBluescriptⅡSK(-)载体转录模板,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序.随后单酶切使模板线性化,利用T7和T3酶体外转录合成一对ZNF216cRNA探针,琼脂糖凝胶电泳及原位杂交技术检测ZNF216 cRNA探针.结果表明,ZNF216 cRNA探针制备成功,其敏感性和可信性高,为深入研究锌指蛋白ZNF216的功能提供了有用的工具.
关键词： 体外转录 地高辛标记 锌指蛋白ZNF216 原位杂交 -
chOPG RNA探针的制备及其在鸡骨组织的原位杂交
目的 制备地高辛标记的禽OPG cRNA探针.方法 将目的片段重组到T载体中,构建chOPG/pGM-Teasy重组质粒,EcORI酶切鉴定并测序验证.分别用SalI和NcoI进行酶切得到线性化DNA模板,用Sp6和T7 RNA聚合酶体外转录合成地高辛标记的正反义RNA探针.运用斑点杂交的方法检验探针的标记效率,并通过骨组织原位杂交反应进一步检测探针标记是否制备成功.结果 成功构建出chOPG/pGM-Teasy质粒.结论 获得的高效正、反义chOPGRNA探针,为进一步研究OPG在蛋鸡各组织中的表达奠定基础.
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大鼠Y染色体探针的制备与鉴定
目的:研究制备地高辛标记的大鼠性别决定基因Y区(Y染色体,SRY)探针,用于检测雄性大鼠来源的细胞在雌性受鼠体内的SRY基因表达情况.方法:按已知的雄性大鼠Y染色体上性别决定基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针.以雌性大鼠为对照,原位杂交法检测大鼠肾组织切片Y染色体阳性细胞情况.结果:用原位杂交法证实在雄性大鼠肾脏内有SRY表达,而雌性大鼠肾脏无Y染色体阳性细胞,证实这种探针具有较高的敏感性和特异性.结论:大鼠性别决定基因SRY探针的制备成功,为进一步研究异体雄性大鼠细胞移植后的分布和表达提供了实验基础.
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地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用
目的制备大鼠神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)地高辛(digoxigenin)标记的RNA探针,探讨nNOS在脊髓中的表达定位.方法采用RT-PCR方法,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段,并经序列测定.以dig-nNOS mRNA为探针,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOS mRNA表达.结果 RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度240 bp相符,T载体克隆测序与nNOS基因100%同源.原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中.结论采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆,dig-nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA.
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大鼠脑组织中CNTF基因克隆及其探针制备
目的克隆大鼠CNTF基因并制备地高辛标记的CNTF探针。方法采用RT-PCR法，从大鼠脑组织mRNA中扩增CNTF基因ORF区片段，克隆入T载体，并经序列测定。以地高辛素标记CNTF基因片段为探针，对成年大鼠脊髓组织切片进行原位杂交。结果 RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度616 bp相符，序列测定与CNTF基因100%同源。原位杂交显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓白质的前索及侧索的周边部分，为杵棒形和三角形带有纤细突起的胶质细胞。结论采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的CNTF基因克隆，地高辛标记的CNTF探针原位杂交显示正常大鼠脊髓白质的部分胶质细胞中表达CNTF mRNA。
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斑点杂交法用于检测烟曲霉菌感染的实验研究
目的:建立一种利用DNA探针快速检测烟曲霉茵的斑点杂交方法.方法:在烟曲霉特异的碱性蛋白酶基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成一段465 bp的DNA探针,用地高辛标记探针并与烟曲霉、黄曲霉、念珠茵、隐球茵等真菌以及细茵DNA行斑点杂交,并将该方法应用于临床标本的检测.结果:所合成的探针具有高度特异性.与其他真菌、细茵间无交叉反应,该方法的敏感性达100fg.100份临床标本曲霉培养阳性者6份.杂交阳性者13份.结论:斑点杂交法具有快速、敏感、特异的优点,对烟曲霉茵感染的快速诊断有重要意义.
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DHBV DNA在鸭胰脾组织中原位杂交的研究
目的：对慢性DHBV感染鸭的肝、胰、脾组织DHBV DNA作对比研究。方法：采用原位杂交技术。结果：DHBV不仅可以感染鸭肝细胞，且可感染胰、脾组织，DHBV DNA阳性细胞的分布密度以肝组织高，胰脾次之。结论：DHBV具有组织器官泛嗜性，但其在肝外组织中的复制似不及在肝细胞中活跃。
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地高辛标记的血小板T细胞活化抗原1cRNA探针的制备与鉴定
目的制备用地高辛(digoxigenin,Dig)标记的血小板T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)cRNA探针.方法构建重组质粒pGEM-3ZF(+)-PTA1,并做序列分析证实PTA1基因的插入方向正确后,用EcoRI消化得到线性DNA片段,再用SP6RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链cRNA探针.结果经斑点杂交证实,该探针敏感性高、特异性强.结论地高辛标记PTA1cRNA探针的制备,为进一步研究PTA1mRNA在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具.
关键词： 血小板T细胞活化抗原1 重组质粒 地高辛标记 cRNA探针 斑点杂交 -
大鼠脑组织中p75基因克隆及其探针制备
为了克隆大鼠p75基因并制备地高辛标记的p75 cDNA探针(dig-p75 cDNA),本研究采用RT-PCR法,从大鼠脑组织mRNA中扩增p75基因mRNA部分片段,克隆入T载体,并经序列测定.以dig-p75 cDNA为探针,采用原位杂交方法观察成年SD大鼠海马组织中p75 mRNA的表达.结果:RT-PCR法扩增出一种特异产物与预期长度386 bp相符,T载体克隆测序与p75基因100%同源.原位杂交结果显示,阳性信号出现在成年大鼠海马组织中.结论:采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织p75基因克隆,dig p75 cDNA探针原位杂交显示正常SD大鼠海马组织中表达p75 mRNA.
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对斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量的影响因素研究
目的:对斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中的6个影响因素进行评价.方法:对不同的样品稀释液,样品中是否含有蛋白,含蛋白样品是否采用蛋白酶K处理,采用不同方法预处理的模板DNA作为标记用模板,采用不同体积的离心管进行探针标记,分别采用不同的杂交温度,共计6个因素对检测结果的影响进行评价.结果:在使用随机标记的探针通过斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中:标准品和样品稀释中使用水进行稀释时结果可信度较高；样品中含有蛋白会降低检测的灵敏度；在含蛋白样品中加入蛋白酶K处理可以在一定程度上提高检测的灵敏度；使用超声处理的模板DNA作为探针标记的模板时,检测灵敏度较高,同时背景较低；探针标记过程中应采用0.2 mL薄壁PCR管作为容器以保证试验成功率；适的杂交温度为42℃左右.结论:在斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量中,采用水作为稀释液,对含蛋白样品使用蛋白酶K消化,标记用模板DNA使用超声处理,使用0.2 mL薄壁PCR管作为标记反应管和在42℃杂交时,结果的稳定性和灵敏度有较大提高.
