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FWA116基因在心衰动物模型心脏血管内皮的表达
建立亚急性和慢性心衰SD大鼠模型,用RNA-RNA原位杂交方法观察新基因FWA116在心脏组织的表达.以重组质粒FWA116/PGEM-T线性cDNA为模板,在T7或SP6RNA聚合酶作用下,体外合成地高辛(DIG)半抗原标记的FWA116cRNA探针.结果表明:与对照组相比,该基因在两种心衰大鼠心脏的中、小动脉内皮组织的mRNA表达均明显增高;与Northern blot及免疫组化的结果相一致,这提示DIG标记cRNA原位杂交方法的敏感和可靠.同时,FWA116基因在心衰缺血缺氧心脏动脉内皮中的转录和翻译水平的高表达,说明该基因可能在心衰的病理过程中起到重要的作用.
关键词： 地高辛(DIG)标记 cRNA探针 原位杂交 基因表达 -
二肽基肽酶Ⅳ与卵巢上皮性癌临床病理特征和预后的关系
目的 探讨卵巢上皮性癌组织中二肽基肽酶N(DPPIV)的表达及临床意义.方法 采用免疫组化法榆测378例卵巢上皮性癌组织中DPPIC蛋白的表达,采用原位杂交法检测86例卵巢上皮性癌组织中DPPIV mRNA的表达,42例正常卵巢组织作为对照.结果 DPPIV蛋白在卵巢上皮件癌组织中的总阳性表达率为92.9%(351/378),在正常卵巢组织中的总阳性表达率为59.5%(25/42),差异有统计学意义(P=0.001).DPPIV蛋门的表达与患者的发病年龄、肿瘤分化程度和FIGO分期无关(均P＞0.05),而与肿瘤的组织学类型有关(P=0.005).DPPIC蛋白的表达水平越高,患者的生存期越短(P=0.023).DPPIV mRNA在卵巢上皮性癌组织巾的总阳性表达率为97.7%(84/86),在正常卵巢组织中的总阳件表达率为64.3%(27/42),差异有统计学意义(P＜0.05).卵巢上皮性癌组织中DPPIV蛋白和mRNA的表达与定位一致,且二者旱止相关(P=0.001).结论 DPPIV在卵巢上皮性癌的发生发展中起着一定作用,其表达水平可能成为影响患者预后的因素.
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TIMP-1在肝纤维化形成过程中的作用
目的研究TIMP-1在肝纤维化形成过程中的作用.方法皮下注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型;RTPCR扩增TIMP-1cDNA片段,定向克隆到转录载体pSPr18上,构建pSPT18/TIMP-1重组质粒,转化E.coli JM109,进行质粒提取、酶切鉴定、序列分析、体外转录合成探针、原位杂交.结果成功建立小鼠肝纤维化模型;获得的TIMP-1目的基因片段大小为262bp,与预期结果相同;经酶切鉴定和序列分析证实成功构建了pSPr18/TIMP-1重组质粒;原位杂交结果显示,TIMP-1主要在激活的肝星型细胞、内皮细胞、间质细胞以及正常肝细胞中表达,且随着肝纤维化的逐步形成,TIMP-1的表达逐渐升高.结论TIMP-1参与肝纤维化的形成过程,并与肝纤维化的程度成正相关.
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甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义
目的 探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法 和意义.方法 取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经Hind Ⅲ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验.结果 TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性.核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果 一致.结论 成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA 的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法 ,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况.
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上皮性卵巢癌组织中DPP Ⅳ mRNA的表达及意义
目的 探讨上皮性卵巢癌组织中二肽基肽酶(DPP) Ⅳ mRNA的表达及临床意义.方法 设计5′端含有T7 RNA聚合酶启动子序列的PCR引物,以质粒pcD26His的cDNA为模板扩增得到DNA片段,并在T7 RNA聚合酶作用下,采用体外转录方法 合成FITC标记的DPP Ⅳ RNA探针,对86例卵巢上皮性癌石蜡包埋组织进行原位杂交,检测其DPP Ⅳ mRNA的表达,12例正常卵巢组织作对照.结果 86例卵巢癌组织中的DPP Ⅳ mRNA 0、1、2、3级表达者分别为2、18、 40和26例,阳性表达率为97.67% (84/86),显著高于对照组的16.66% (2/12),P＜0.01;其表达与卵巢癌组织学分级和临床分期有关.结论 DPP Ⅳ mRNA在卵巢癌组织中的表达增高,在卵巢癌的发生发展中起一定作用.
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地高辛标记的血小板T细胞活化抗原1cRNA探针的制备与鉴定
目的制备用地高辛(digoxigenin,Dig)标记的血小板T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)cRNA探针.方法构建重组质粒pGEM-3ZF(+)-PTA1,并做序列分析证实PTA1基因的插入方向正确后,用EcoRI消化得到线性DNA片段,再用SP6RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链cRNA探针.结果经斑点杂交证实,该探针敏感性高、特异性强.结论地高辛标记PTA1cRNA探针的制备,为进一步研究PTA1mRNA在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具.
关键词： 血小板T细胞活化抗原1 重组质粒 地高辛标记 cRNA探针 斑点杂交 -
小鼠Brd2基因探针的制备及其在荧光原位杂交实验中的应用
目的:为观察溴结构域包含蛋白2(bromodomain containing protein 2,Brd2)基因在小鼠中枢神经系统的表达与分布,本研究制备了两条地高辛标记的Brd2 cRNA探针.方法:提取小鼠脑组织总RNA,设计两对Brd2引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增得到两个Brd2的DNA片段,并将它们分别克隆到pCRⅡ-TOPO载体中.利用体外转录方法合成地高辛标记的cRNA探针,后通过荧光原位杂交实验分析所标记探针的特异性及杂交效果.结果:本实验成功构建了两个Brd2/pCRⅡ-TOPO质粒,获得了特异性的地高辛标记的Brd2cRNA探针,在荧光原位杂交实验中应用两条探针得到了较好的杂交信号.结论:本实验制备的地高辛标记的cRNA探针可特异地检测Brd2 mRNA,为进一步观察Brd2 mRNA在中枢神经系统的分布及功能研究提供了工具.
