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基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化
目的:对已构建好的表达pZP3β蛋白(pZP130)工程菌的培养条件进行优化,通过在5 L罐中发酵和Ni柱纯化,以期获取较大量目的产物.方法:在摇瓶中改变不同的培养及诱导条件,比较工程菌的生长和目的蛋白的表达,优化发酵条件;并在5 L发酵罐中进行发酵,获得菌体,破碎后进行Ni柱纯化.结果:优化的发酵条件是:10%的接种量,加入2%甘油的培养基培养菌体3 h后加入0.5 mmol/L IPTG,诱导4 h后收样.在5 L发酵罐中发酵,获得菌体量36g/L,经Ni柱纯化,获得蛋白粗制品33 mg/L发酵液.结论:截短型pZP3β蛋白可以在E coli中获得较高表达,并且可以通过发酵和Ni柱纯化得到较大量的蛋白,这有助于pZP的深入研究和应用.
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猪卵透明带-3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究
目的:制备具有猪卵透明带-3β抗原活性的截短型pZP3β蛋白(tunc-pZP3β),以便对该蛋白的抗原表位区域作深入研究.方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第130个氨基酸到第290个氨基酸的DNA序列.获得的tunc-pZP3β基因片段通过引入其两端的Nde I和BamH I酶切位点被定向插入pET-3c质粒T7强启动子下游的多克隆区,筛选出重组子,经DNA测序验证正确后,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,再用IPTG对重组菌体进行诱导.结果:SDS-PAGE分析表明tuncpZP3β在大肠杆菌系统中高水平表达,且在Western Blot免疫印迹中能被特异性抗体识别.结论:对适当的抗原表位序列进行保留而截去两端一定的氨基酸序列,所获得的截短型蛋白能够实现在大肠杆菌中高效表达,这有利于深入研究该蛋白核心区域的功能.
关键词： 截短型 猪卵透明带-3 β:大肠杆菌 表达 -
翻译起始区突变对猪卵透明带-3β蛋白在E.coli表达的影响
目的:探讨翻译起始区(translationinitiation region,TIR)突变对两种氨基酸序列长度不同的猪卵透明带蛋白pZP3β161和pZP3β 263在大肠杆菌中表达的影响.方法:应用DNASIS软件辅助分析,分别设计5条不同的上游引物对两种pZP3β基因的TIR区的G+C含量和自由能进行合理调整,PCR扩增后将获得的基因片段克隆入pET-3c载体,于大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达.结果:TIR对pZP3β表达有明显的影响,其表达的pZP3β 161蛋白和pZP3β 263蛋白分别占菌总蛋白的25%和15%.结论:在不改变氨基酸的条件下,通过对目的基因TIR进行适当改造,能够有效提高目的蛋白的表达效率.
关键词： 猪卵透明带 截短型 翻译起始区(TIR) 基因表达
