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第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景
由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗.但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high-capacity or gutted or help-dependent Adenovirus,HD-AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述.
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clpC 基因对变异链球菌感受态形成的影响
目的：构建变异链球菌clpC缺陷突变株，检测该基因对变异链球菌感受态形成的影响。方法分别以变异链球菌UA159基因组和pIB107质粒为模板，PCR扩增clpC基因片段和卡那霉素基因盒（lox71-KMR-lox66）；将clpC基因片段插入pMD-19T simple载体，经ClaⅠ／EcoRⅠ酶切、补平后连入卡那霉素基因盒，构建clpC缺陷突变同源重组载体pCKX2；SalⅠ线性化pCKX2并转化变异链球菌，卡那霉素筛选阳性菌落；质粒pCrePA转化阳性菌株，30℃培养剔除卡那霉素基因盒；37℃培养去除pCrePA，获得clpC缺陷突变株，PCR和测序鉴定；提取细菌总RNA并逆转录成cDNA，用RT-PCR法扩增clpC缺失序列的核苷酸片段并进行产物的电泳分析；pDL276分别转化变异链球菌和clpC缺陷突变株，观察感受态细胞形成变化。结果 PCR和测序结果证实成功构建同源重组载体pCKX2及变异链球菌clpC缺陷突变株；RT-PCR结果显示，△clpC缺失的核苷酸片段PCR产物电泳结果并无相应的条带出现；clpC缺陷突变株的感受态形成期延迟并延长维持期。结论 clpC基因具有负调控变异链球菌晚期感受态细胞形成的作用。
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针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体的构建及功能鉴定
目的 设计构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,以用于制备相关转基因小鼠,并在体外验证其有效性.方法 剔除pcDNA3.1载体的CMV启动予以及多克隆位点,然后接入带有LacZ-fLoxP插入失活的小鼠U6启动子并引入适当的酶切位点,装入设计好的shRNA片段,测试shRNA抑制Chmp1b表达的效率与专一性,检查Cre重组酶介导位点特异性重组去除LoxP位点之间的lac基因后U6启动子活性恢复情况.结果 设计的shRNA片段可明显降低Chmp1b的表达,抑制效率达90％以上;成功构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,插入U6启动子中的LacZ-fLoxP片段既可以控制U6启动子活性又可以起到报告基因的作用.结论 针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体可以用于制备相关转基因小鼠.
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肝脏特异性DEK基因敲除小鼠模型的制备及鉴定
目的 利用Cre/loxp基因敲除技术构建肝脏特异性DEK基因敲除小鼠,为研究DEK基因在肝脏中的生物学功能提供重要动物模型.方法 将DEKflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配和鉴定,筛选出子代中DEKflox/+/Alb-Cre小鼠与DEKflox/flox小鼠进行交配与鉴定,获得DEKflox/flox/Alb-Cre小鼠,将DEKflox/flox/Alb-Cre小鼠与DEKflox/flox小鼠进行交配,其子代基因型为DEKflox/flox/Alb-Cre的小鼠即为本实验所构建的肝脏特异性DEK基因敲除小鼠,DEKflox/flox小鼠即为对照小鼠.提取小鼠尾基因组DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;提取小鼠肝脏RNA和总蛋白,利用Real-TimePCR和Western Blotting技术检验DEK基因在小鼠肝脏中的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况,使用激光共聚焦检测DEK蛋白在小鼠肝脏的表达情况;对小鼠肝脏行苏木精-伊红染色观察小鼠肝组织的形态学变化.结果 PCR结果表明子代小鼠基因型符合DEKflox/flox/Alb-Cre;肝脏特异性DEK基因敲除小鼠肝组织中DEK基因的mRNA水平及蛋白质水平显著低于DEKflox/flox型小鼠;肝脏特异性DEK基因敲除小鼠肝组织的形态学特征与对照组小鼠相比无明显差异.结论 本研究利用Cre/Loxp技术成功构建了肝脏特异性DEK基因敲除小鼠,为在动物水平进一步研究DEK基因的作用提供了重要动物模型.
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髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠的构建与鉴定
目的 利用FLP/FRT、Cre/Loxp重组酶系统构建并鉴定髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为深入研究SETD4的生物学功能奠定基础.方法 将引进的Setd4flox/+小鼠自交,筛选出子代基因型为Setd4flox/flox的小鼠;与FLP小鼠交配,得到Setd4fl/+/flp小鼠;然后分别与C57BL/6小鼠交配去除FLP酶,筛选出Setd4fl/+小鼠;与Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4fl/+/Lyz2-Cre小鼠;将得到的Setd4fl/+和Setd4fl/+/Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4-/-/Lyz2-Cre小鼠,即髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠.利用PCR技术鉴定小鼠基因型;实时荧光定量PCR技术检测小鼠腹腔巨噬细胞及肝组织中SETD4的mRNA表达水平验证敲除情况.结果 髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中SETD4 mRNA水平较野生型小鼠显著降低;而在肝组织中无显著差异.结论 利用FLP/FRT、Cre/Loxp系统成功构建髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为后续的功能学研究提供了动物模型.
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基因工程小鼠星形细胞瘤模型的研究进展
星形细胞瘤是来源于星形细胞或星形前体细胞的中枢神经系统肿瘤,约占所有颅内原发性肿瘤的45%.为了更好的治疗此类疾病,人们试图构建各种基因工程小鼠,建立小鼠星形细胞瘤的模型,以便于更好的研究肿瘤的发病机制和验证新的治疗方法.本文对基因工程小鼠星形细胞瘤模型的研究进展作一综述.
