首页 > 文献资料
-
FAK突变体的亚细胞定位及生物学特性
目的：探讨外显子33缺失型黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）突变体（FAK-Del33）的亚细胞定位及生物学特性。方法采用基础实验研究设计。将野生型FAK以及突变型FAK-Del33分别构建到pEGFP表达载体,并转染乳腺癌细胞株,以研究分析其细胞表达和定位情况。另构建过表达FAK或FAK-Del33的MDA-MB-468乳腺癌稳转细胞株，研究评价其细胞表达和体外克隆形成能力。结果构建FAK-GFP融合蛋白表达载体转染MDA-MB-468后的细胞定位显示，野生型FAK在胞浆中弥散分布，而FA K突变体蛋白在胞浆中呈点状不均匀分布，并聚集成簇。经限制性内切酶酶切分析与测序分析，成功构建出过表达FAK的慢病毒载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染乳腺癌细胞；经抗生素puromycin筛选和荧光定量PCR鉴定，成功筛选到稳定表达FAK的细胞株。在软琼脂克隆形成实验中，FAK野生型的克隆形成数为（335±48）/1000个，FAK突变体为（735±91）/1000个，后者对MDA-MB-468乳腺癌稳转细胞株的增殖能力高于前者（t=9.437， P＜0.01）。结论初步研究表明外显子33缺失可改变FAK的亚细胞定位；并能增强肿瘤细胞株的体外克隆形成能力，这种FAK突变体可能参与肿瘤的发生发展。
-
FHL1抗体的制备与特异性鉴定
目的: 制备FHL1及其剪接体FHL1B、 FHL1C的多克隆抗体, 并对其特异性进行鉴定.方法: 融合表达GST-FHL1蛋白, 常规免疫小鼠, 制备多克隆抗体.分别构建带有FLAG标签的FHL1-5、 FHL1B、 FHL1C以及FHL1 N端和C端缺失突变体的真核表达载体.Western blot检测抗体的特异性.结果: 获得了FHL1-5、 FHL1B、 FHL1C及FHL1(1-169 aa)和FHL1(168-280 aa)的真核表达载体; 得到的多克隆抗体可特异识别FHL1、 FHL1B和FHL1C, 而不识别FHL2-5; 抗体与FHL1 N端反应, 而不与其C端反应.结论: 成功得到可特异识别FHL1、 FHL1B和FHL1C的多克隆抗体, 为进一步研究FHL1及其剪接突变体的功能奠定了坚实的基础.
