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人类唾液和牙结石中纳米细菌的分离培养及形态观察
目的：从人类牙结石中分离培养纳米细菌，初步探讨纳米细菌和牙周炎之间的关系。方法取23例牙周炎患者的唾液和牙结石，分离并培养纳米细菌，扫描电镜观察形态。结果从唾液和结石样本中均观察到了纳米细菌的存在。结论从牙周炎患者的唾液和牙结石中检出纳米细菌，其与牙周炎的相关性有待进一步探讨。
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肾结石两种造模方式血、尿生化的动态比对研究
目的 构建两种大鼠肾结石疾病模型,为肾结石病因学的探索提供支持.方法 将60只大鼠随机分为纳米细菌(Nanobacteria,NB)组(NB组,尾静脉注射1.2 mL NB悬液,30只)和乙二醇组(EG组,1.25％乙二醇饮水+1％氯化铵2 mL/d灌胃,灌胃持续时间为2 w,30只),实验周期为10 w,每周每组各处死大鼠3只,处死前采集大鼠血、尿标本,肾脏标本.结果 两组大鼠一般情况差异显著,肾体比差异不显著;病理结晶数差异不显著;纳米细菌组与乙二醇组相比,血钙、血镁、血磷、肌酐、尿酸、尿素的差异不显著(P>0.05);尿钙、尿pH、尿比重、24 h尿量的差异不显著(P>0.05).结论 两种造模方式,就研究指标来看,差异无显著性,表明了纳米细菌造模的可行性.相较于传统的乙二醇造模方式,NB造模具有更加温和的优点,且NB来源于肾结石本身,这一造模方式与人体肾结石形成更加相似,更有利于肾结石成因的研究.
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胆汁纳米细菌的培养与鉴定
目的探讨纳米细菌在胆汁中的分布情况及微生物学特性,并对其鉴定方法进行评价.方法对75例胆囊胆汁标本进行纳米细菌培养,观察其生长情况,并采用免疫组化染色、透射电镜扫描和钙染色进行纳米细菌鉴定.结果胆汁中纳米细菌感染率为61.3%,其中出现完全或部分黏附于管底壁的白色沉淀者,纳米细菌阳性率为75.7%,而沉淀完全呈絮状或无沉淀者,阳性率为47.4%,两者间存在显著性差异.免疫组化染色阳性的胆汁标本经透射电镜扫描均发现纳米细菌.钙染色的阳性率为38.7%, 与免疫组化染色相比较,其灵敏度为58.7%, 特异度为93.1%,假阳性率6.9%,假阴性率41.3%.结论纳米细菌单克隆抗体联合透射电镜扫描可鉴定纳米细菌;钙染色对纳米细菌的鉴定有着重要的参考价值;紧密黏附于管底的白色沉淀是纳米细菌培养过程中的一个重要微生物学特性.
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纳米细菌诱发泌尿系结石形成研究现状分析
在泌尿系统中,结石是常见病与多发病,不仅对人们的身体健康带来影响,还降低了人们的生活质量.有关泌尿系统结石的患病因素长期以来有较多的理论与学说,受幽门螺杆菌的影响及启发,近些年来,纳米细菌受到国内外诸多学者的广泛关注,但纳米细菌是否属于真实的生命体、如何促使有关疾病发生等方面尚存在较大的争议.当下普遍认为泌尿系结石是由多种因素相互作用导致的.因纳米细菌矿化能力较为独特,且在生长过程中可在菌体附近产生羟磷灰石矿化外壳,进而形成晶体核心,成为活动中心,可对肾乳头细胞以及肾集合管上皮细胞造成黏附、入侵以及破坏,因此给泌尿系结石的患病机制、预防以及治疗等提供了新的研究热点.现就纳米细菌的生物作用与本质进行介绍,并对纳米细菌诱发泌尿系结石的研究进展进行综述.
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胆汁纳米细菌培养及鉴定
①目的 探讨胆汁中纳米细菌的培养、鉴定方法及微生物学特性.②方法 对6例胆结石患者胆汁标本进行纳米细菌培养,观察其生长情况.采用透射电镜、间接免疫荧光染色、Von KOSSA钙染色进行纳米细菌鉴定并采用扫描电镜对其进行能谱分析.③结果 6例胆结石患者胆汁标本纳米细菌培养均为阳性;透射电镜下观察,纳米细菌约为80～350nm,呈椭球形或短棒状,聚集成簇状,其表面被覆细菌被膜;经Von KOSSA法钙染色,其形成的矿化外壳呈黑色;间接免疫荧光染色显示纳米细菌被荧光标记抗体结合,呈绿色荧光颗粒.扫描电镜能谱分析(EDX)显示,纳米细菌外壳含有钙、磷、镁等元素,其钙/磷比值为1.62;④结论 胆囊结石患者胆汁中存在纳米细菌感染.纳米细菌体积微小,生长缓慢,能在生理条件下于其菌体表面产生矿化外壳.纳米细菌单克隆抗体联合透射电镜可鉴定纳米细菌,钙染色对纳米细菌的鉴定有着重要的参考价值.
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纳米细菌致兔胆囊结石的研究
①目的 通过对胆汁培养的纳米细菌(Nanobacteria Nb)感染日本大耳白兔致胆结石形成,探讨纳米细菌感染与胆石症发生的相关性.②方法 用从胆汁中培养出的纳米细菌感染日本大耳白兔,3周后处死日本大耳白兔,记录成石情况.③结果 胆石症患者胆汁纳米细菌感染性实验中纳米细菌感染组胆结石发生率81.25%与DMEM对照组6.25%和羟基磷灰石(Hap)对照组18.75%比较,差异有统计学意义(P＜0.05).日本大耳白兔胆汁纳米细菌感染性实验中Nb感染组胆结石发生率56.25%与含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(DMEM)对照组6.25%和灭活纳米细菌对照组12.50%比较,差异有统计学意义P＜0.05.④结论 实验动物感染纳米细菌后能在短期内产生胆囊结石;由被感染的实验日本大耳白兔胆汁培养出的纳米细菌能再次感染日本大耳白兔并致胆结石形成.
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纳米细菌对肾小管上皮细胞损伤在肾结石形成中作用的研究
目的 探究纳米细菌(NB)损伤人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)并导致晶体滞留的机制.方法 于2016年10月—2017年10月在石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科收集临床确诊肾结石且未应用药物或手术治疗患者的尿液培养NB.实验分为5组:对照组(胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞)、NB组(NB菌液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞)、一水草酸钙(COM)组(5 mmol/L COM悬液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞)、纳米级羟基磷灰石(nHAP)组(300 mg/L nHAP、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞)和四环素干扰组(5 mg/L四环素、NB菌液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞).共同培养6、12、24 h后,采用光学显微镜及透射电子显微镜观察HK-2细胞的形态学变化;超声粉碎细胞后检测Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性;检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量;用激光扫描共聚焦显微镜观察加入COM晶体后各组细胞的晶体黏附情况.结果 苏木素-伊红(HE)染色和透射电子显微镜结果可见,nHAP组和四环素干扰组HK-2细胞的损伤程度明显低于NB组.共同培养12、24 h后,NB组和COM组Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于对照组,H2O2含量均高于对照组(P<0.05),nHAP组Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于对照组(P<0.05),四环素干扰组Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均高于NB组(P<0.05).共同培养6、12、24 h后,NB组和COM组MDA含量均高于对照组(P<0.05),四环素干扰组MDA含量均低于NB组(P<0.05),COM组LDH含量均高于对照组(P<0.05),nHAP组、四环素干扰组LDH含量均低于COM组(P<0.05).结论 NB可能通过诱导脂质过氧化反应损伤HK-2细胞,损伤程度和晶体黏附量与NB作用时间呈正比.四环素可以抑制NB对HK-2细胞的损伤并减少损伤后的晶体滞留.
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纳米细菌大鼠肾结石模型肾脏结石形成时间的动态研究
目的 采用微计算机断层扫描技术(Mirco-CT)和病理组织学检查动态观察纳米细菌诱导的大鼠肾结石模型肾脏结石形成情况.方法 2015年11月-2016年6月,将60只SPF级Wistar大鼠适应性饲养1周后,随机分为对照组和诱石组,各30只.对照组大鼠一次性尾静脉注射0.9%氯化钠溶液1.2 ml,诱石组大鼠一次性尾静脉注射纳米细菌悬液1.2 ml.两组大鼠注射后第1~10周每周处死3只,收集双侧肾脏待测.采用Mirco-CT检查两组大鼠肾脏,统计第1~10周两组大鼠检测到的肾脏高密度影情况.光学显微镜下观察两组大鼠肾脏晶体的形成情况,统计第1~10周两组大鼠肾脏晶体阳性情况.结果 Mirco-CT扫描结果:第1~10周,对照组大鼠肾脏均未见高密度影;第7~10周诱石组大鼠肾脏可见白色颗粒样高密度影.第1~10周,诱石组大鼠肾脏高密度影检出4只(13.3%),对照组未检出;截至第10周末,两组大鼠肾脏高密度影检出率比较,差异无统计学意义(P=0.056).病理组织学检查结果:第1~10周,对照组大鼠肾脏内无晶体沉积.第4周及第6~10周诱石组大鼠肾脏可见灰白色晶体.第1~10周,诱石组大鼠肾脏晶体阳性11只(36.7%),对照组均为阴性;截至第10周末,诱石组大鼠肾脏晶体阳性率高于对照组(P<0.001).结论 纳米细菌在第4周开始诱导大鼠肾脏形成结晶,这个病理过程在第6~10周持续存在,Mirco-CT检查可见第7~10周形成高密度结石样物质,纳米细菌可能通过早期损伤肾脏诱导结晶形成并进一步产生结石.
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纳米细菌与感染和相关钙化性疾病研究进展
1985年芬兰科学家Kajander等[1]发现了一种可以自我复制矿化且直径只有50-800 nm的微生物,包括了一类革兰氏染色阴性、基因序列是16SrRNA的颗粒性物质,称为纳米细菌(nanobacteria,NB).NB的大特点是在生理性钙磷浓度中生成磷灰石碳酸盐结晶,形成牢固的钙化外包裹,引起细胞的空泡样变性、坏死及组织炎症反应[2].其特征决定了与一些疾病具有相关性,尤其与感染和病理性钙化性疾病密切相关.目前研究发现许多疾病发生发展过程中均有磷酸钙沉积现象,如泌尿系结石、Ⅲ型前列腺炎、间质性膀胱炎、动脉粥样硬化和胎盘钙化等,但形成机制尚不确定.本文旨对纳米细菌与感染和钙化性疾病的研究进展做一综述.
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正常人和肝病患者血中"致密体"及其与纳米细菌的关系
目的 研究正常和肝病患者血液中圆球体样微生物的生物学特性,初步确定纳米细菌与该种可滤过物的关系.方法 将正常人和肝病患者培养阴性的血培养物进行细菌L型、真菌和厌氧菌培养.同时取沉淀用透射电镜观察.L型培养液用0.45μm和0.22μm滤器过滤,接种RPMI 1640培养基,细胞培养条件下培养45d,用鼠抗纳米细菌单克隆抗体8D10免疫组化和钙盐染色进行纳米细菌鉴定.血浆纳米细菌培养阳性者12000×g离心后,进行普通和L型细菌培养.结果 36/39患者和60/60健康对照血培养液中呈现类似于L型的巨型体、圆球体、原生小体的不明微生物.电镜观察圆球体内为电子致密样物质,周围未见细胞壁结构.电镜和光镜下可见其粘附在红细胞上或存在于红细胞内.滤过后培养物钙盐染色有5/39阳性,但纳米细菌免疫组化染色均阴性.纳米细菌阳性的培养物转种,未见一般细菌、细菌L型和上述血中"致密体".结论 血培养中致密体样微生物与纳米细菌无关,可能在维持机体正常免疫功能上具有一定意义.
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纳米细菌对人成骨细胞C3H10的细胞毒作用
目的 比较纳米细菌(nanobacteria,NB)与羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)对成骨细胞的细胞毒作用,进一步探讨引起细胞毒作用的机制.方法 实验分为正常对照组、HA组、NB组,其中HA组和NB组悬液浓度均为2麦氏浊度(M),对照组只加培养基,分别作用成骨细胞,通过CCK-8试剂盒检测其对细胞的增殖抑制作用;采用Hoechest33258荧光染色和Annexin V-FITC/PC双标法流式细胞仪(flow cotymetry)检测细胞凋亡率;倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态的变化;Western blot法检测钙化相关蛋白BMP-2、凋亡相关蛋白Bax的表达.结果 CCK-8结果显示:NB对人成骨细胞C3H10有细胞增殖抑制作用,而HA则没有.Hoechst33258荧光染色和双标法流式细胞仪结果显示:NB对人成骨细胞C3H10主要通过促进细胞凋亡发挥细胞毒作用,而HA对人成骨细胞C3H10无细胞毒性作用.在倒置显微镜下观察,作用48 h后的人成骨细胞C3H10形态无明显变化.透射电镜结果显示:NB可引起人成骨细胞C3H10发生凋亡,出现凋亡小体;而HA组和对照组无明显变化.Western blot结果显示:NB组的钙化相关蛋白BMP-2和凋亡相关蛋白Bax均高于对照组;而HA组和对照组比较,HA组钙化相关蛋白BMP-2高于对照组,而凋亡相关蛋白Bax无明显变化.结论 与对照组比较,纳米细菌能引起人成骨细胞C3H10细胞毒性作用,主要是通过促进细胞凋亡发挥细胞毒作用,能促进钙化相关蛋白BMP-2的表达,凋亡相关蛋白Bax的表达升高也预示着纳米细菌可促进细胞发生凋亡;而羟基磷灰石对人成骨细胞C3H10无细胞毒性作用,可促进钙化相关蛋白BMP-2的表达,但不能促进人成骨细胞C3H10发生凋亡.
关键词： 纳米细菌 羟基磷灰石 人成骨细胞C3H10 -
对纳米细菌在牙结石形成过程中的作用的初步研究
目的 探讨牙结石中是否含有纳米细菌及其在牙结石形成过程中的作用.方法 ELISA法、免疫荧光染色、透射电镜方法、化学成分分析.结果 ELISA检测结果显示20例牙周病患者的龈沟液和牙结石分离培养物中阳性结果分别为2例、16例.通过免疫荧光染色、透射电镜方法检测并观察到牙结石及牙结石分离培养物中均存在纳米细菌,化学成分分析证明了纳米细菌分泌晶体成分同牙结石主要化学成分相同.结论 本研究证实了牙结石中存在纳米细菌,并且纳米细菌作为矿化中心参与牙结石形成.
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乌梅提取物对纳米细菌致大鼠肾损伤的修复与拮抗结石生成的关系研究
目的 构建纳米细菌(NB)致肾结石大鼠模型,观察乌梅提取物对早期肾损伤分子1(KIM-1)和骨桥蛋白(OPN)的影响,分析乌梅提取物对早期肾结石的治疗意义.方法 从人上尿路结石分离并培养NB.将54只雄性SD大鼠随机分为空白组、诱石组和治疗组,采取尾静脉注射NB构建肾结石模型,以乌梅提取物干预模型,并在不同时期分批处死大鼠,实时PCR检测肾组织KIM-1 mRNA的表达,ELISA检测尿KIM-1浓度,HE染色观察肾组织结石晶体情况,并用免疫组化方法检测OPN表达.结果 诱石组及治疗组肾结石模型大鼠出现肾小管扩张,肾小管结石晶体形成,早期KIM-1和OPN的表达升高,上述变化与NB的注射时间呈正相关,乌梅提取物可拮抗该类变化.结论 乌梅提取物可能通过修复肾损伤减少肾结石形成,该机制可能与乌梅提取物对KIM-1、OPN的基因调节有关.
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纳米细菌与冠心病
近新发现的纳米细菌是目前已知的小的细菌,其直径为几十至几百纳米.与其它细菌不同,它们是一种生长繁殖缓慢,能通过普通滤菌器(0.2um),吴有生物矿化作用和一定抗辐射能力,革兰氏染色阴性的球形细菌.它们特殊的生物学特性是可以在生理状态的钙、磷浓度下分泌主要由羟磷石灰碳酸盐构成的保护性外壳.因此,它们被认为与机体内病理性钙化密切相关.近年来研究发现,它们可能是冠心病的一种感染性致病源.抗纳米细菌治疗的临床实验显示在冠心病患者中具有一定疗效.
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"纳米细菌"与疾病的研究进展
20世纪80年代后期,芬兰科学家Kajander等在进行哺乳动物细胞培养时,用透射电子显微镜扫描检查时发现细胞内存在一种超微结构.1990年他正式将这种原核微生物命名为"纳米细菌"(nanobacteria,NB),并申请了专利,后来将其称为"钙化性纳米颗粒"(calcifying nanoparticles,CNP).
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钙化胎盘及脐带血中纳米细菌的形态学观察
目的 研究纳米细菌(nanobacteria,NB)的分布,寻求检测胎盘钙化NB感染的更好组织来源.方法 收集孕妇胎盘钙化组织和脐带血20例,并以20例正常胎盘组织作对照,分离培养NB；用革兰染色和茜素红染色法、扫描电镜和透射电镜进行形态学鉴定.结果 培养沉淀物符合NB的特性.脐带血NB分离率为80％(16/20),钙化胎盘组织为65％(13/20),均明显高于正常胎盘组织的10％(2/20),X2分别为12.07、9.09,P均＜0.01；脐带血与钙化胎盘组织比较,差异无统计学意义(x2=1.33,P＞0.05).油镜下脐带血和钙化胎盘组织分离的NB为球状或球杆状,形态相似；茜素红染色脐带血中NB较多且聚集成簇；透射电镜和扫描电镜下NB呈球形,大小为80 ～ 500 nm,并可见毛刺结构.结论 胎盘钙化与NB感染有关,脐带血适用于检测钙化胎盘的NB感染.
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肾结石患者血清中纳米细菌的分离与培养
目的分离培养肾结石患者血清中纳米细菌,探讨纳米细菌感染与肾结石发病之间的关系.方法取40例肾结石患者血清,经0.22μm滤膜过滤后,用RPMI 1640细胞培养基于37℃,5%CO2环境中培养,用显微摄影技术记录结果;以40例健康成人血清为对照.结果22例(55%)肾结石患者血清、8例(20%)对照血清中分离到纳米细菌.经x2检验,差异具有显著性(P＜0.05).结论肾结石患者血清中纳米细菌检出率高于正常人血清,提示纳米细菌感染与肾结石发生可能有关.
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Ⅲ型前列腺炎患者前列腺钙化的临床分析
慢性前列腺炎发病率高,与男性健康关系密切.据统计,前列腺炎是50岁以下男性中常见的泌尿系统疾病<'[1]>.慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征(CP/CPPS)是美国国立卫生研究院(NIH)对前列腺炎新分类方法中的Ⅲ型前列腺炎,也是多见的临床类型,病因不明,治疗困难.由于其常伴有前列腺钙化灶存在,抗生素治疗效果不明显,提示可能存在常规检查无法发现的感染物.
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CaSR在肾结石模型大鼠肾组织中的表达
目的 探讨两种肾结石模型大鼠肾组织中钙敏感受体(CaSR)的表达.方法 选取90只Wistar雄性大鼠随机均分为三组:纳米细菌组大鼠尾静脉注射纳米细菌悬液1.2 ml,生理盐水2 ml灌胃;乙二醇组大鼠尾静脉注射生理盐水1.2 ml,1％乙二醇溶液2 ml和2％氯化铵2 ml灌胃;对照组大鼠尾静脉注射生理盐水1.2ml,生理盐水2 ml灌胃.每天用药1次,连续7d.造模后1～10周,病理学方法检测大鼠肾组织结晶形成情况,免疫组化检测CaSR蛋白的表达情况.结果 对照组大鼠肾组织未见结晶,第3周起乙二醇组大鼠肾组织可见明亮晶体,第4周起纳米细菌组大鼠肾组织也出现晶体.CaSR蛋白在三组大鼠肾组织中均持续表达.第3周起,乙二醇组大鼠肾组织中CaSR蛋白表达增强;第4周起,纳米细菌组大鼠肾组织中CaSR蛋白表达也开始增强;对照组肾组织中CaSR蛋白无明显改变.第3周起,乙二醇组大鼠肾组织CaSR蛋白表达强于纳米细菌组和对照组(P＜0.05).结论 乙二醇和纳米细菌肾结石模型大鼠肾组织中均出现结晶,且CaSR蛋白表达升高,可为肾结石病因学的研究提供实验基础.
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CaSR和Claudin-14在纳米细菌肾结石形成中表达的动态研究
目的 纳米细菌是引起泌尿系结石的因素之一,但是其确切致病机制仍不明确.文章通过尾静脉注射纳米细菌构建肾结石模型检测CaSR和Claudin-14蛋白的表达情况,初步探讨CaSR-Claudin-14调控通道在纳米细菌形成结石中的作用.方法 60只Wistar雄性大鼠随机数字表法分为对照组和纳米细菌组,每组30只.对照组大鼠一次性给予尾静脉注射0.9％氯化钠注射液1.2mL,纳米细菌组Wistar雄性大鼠一次性给予尾静脉注射纳米细菌悬浊液1.2mL.2组大鼠注射后的1～10周内每周处死3只.每周采用病理组织学方法评估大鼠成石情况,并通过免疫组化法连续10周检测CaSR、Claudin-14蛋白的表达.结果 注射后第1～10周,对照组Wistar雄性大鼠肾内未见晶体颗粒沉积,纳米细菌组Wistar雄性大鼠肾晶体颗粒阳性率高于对照组(52.4％vs 0％,P<0.01).注射后第1～3周,纳米细菌组中有CaSR表达,而Claudin-14未见表达,但与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);注射后第4～10周纳米细菌组2种蛋白表达强度逐渐增强且表达强度明显高于对照组,呈棕褐色,主要分布在肾小管上皮细胞的细胞膜上.结论 CaSR-Claudin-14调控通道活性增强可能在纳米细菌形成结石中起重要作用.
关键词： CaSR claudin-14 纳米细菌 肾结石
