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2009-2011年杭州地区儿童人类偏肺病毒感染状况及病原特征分析
目的 了解杭州地区儿童急性呼吸道感染病例中人类偏肺病毒(hMPV)感染状况及病原特征.方法 选取2009年11月至2010年1月、2010年11月至2011年1月杭州3家医院儿科门诊、重症监护室14岁以下急性呼吸道感染患儿372例作为研究对象,采集其咽拭子351份、鼻咽吸取物9份、气管吸取物8份、痰液4份,共372份标本.提取总核酸,用RT-PCR扩增hMPV的核蛋白(N)基因片段,取扩增阳性产物进行基因测序和序列分析,扩增阳性的标本用非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)培养hMPV,同时,用荧光定量RT-PCR方法检测呼吸道其他病毒共感染情况.结果 372份患儿标本检测hMPV的N基因阳性42份,检出率为11.2％.男性患儿hMPV阳性率为11.5％(26/226),女性患儿为10.9％ (16/146),差异无统计学意义(x2=0.026,P＞0.05).感染患儿年龄小2个月,大14岁,发病年龄中位数为24个月.取15份RT-PCR扩增阳性产物进行基因序列分析,结果均为B1亚型,与广东株GD165相似度为98.1％～99.5％,与北京株BJ 1897相似度为87.8％ ～ 89.2％.hMPV与其他呼吸道病毒共同感染率为45.2％ (19/42),其中与呼吸道合胞病毒共同感染检出率高,为26.1％ (11/42).结论 杭州地区部分儿童的急性呼吸道感染与hMPV有关,hMPV为单一基因型,与其他呼吸道病毒存在共同感染的现象.
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人偏肺病毒DNA疫苗的构建和小鼠免疫反应的研究
目的 构建人偏肺病毒(hMPV)DNA疫苗,小鼠免疫后评价其细胞和体液免疫水平.方法 利用PCR方法,从hMPV的cDNA中扩增融合蛋白FATM(缺失跨膜区)基因和基质蛋白M基因,构建DNA疫苗pcDNA3.1His-FATM和pcDNA3.1His-M,瞬时转染后用Western Blot和间接免疫荧光方法检测F、M蛋白表达.疫苗肌内注射免疫小鼠,ELISA和ELISPOT方法分别检测血清IgG抗体和小鼠脾细胞CTL水平.结果 Western Blot和间接免疫荧光(IFA)方法证明构建的疫苗可表达FATM和M蛋白.peDNA3.1His-FATM单独免疫小鼠,血清抗体滴度为1:44;与pcDNA3.1His-M联合免疫后,血清抗体滴度为1:64.ELISPOT检测证明,联合免疫组小鼠脾细胞产生IFN-γ的效应CD8+T细胞数为42±8.9,高于单独免疫组32±7.4的水平.结论 DNA疫苗peDNA3.1His-F△TM可以诱导产生特异性的体液和细胞免疫,与pcDNA3.1His-M联合免疫,可以提高免疫水平.
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2007-2011年长沙地区急性下呼吸道感染住院儿童人偏肺病毒的流行状况
目的 了解人偏肺病毒(hMPV)在长沙地区急性下呼吸道感染住院患儿中的流行病学特点.方法 收集2007年9月至2011年2月因急性下呼吸道感染在湖南省人民医院儿科医学中心住院儿童的鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPA)样本2613份,采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测hMPV M基因,将阳性PCR扩增产物测序并与GenBank中已知的hMPV参考株进行比对、分析.结果 2613份标本中hMPV阳性检出数135例,检出率为5.2％,男女之间的检出率比较有统计学差异(x2=8.007,P=0.003),hMPV阳性检出患儿的年龄以1岁以内多见(63.2％).hMPV阳性检出率在春季呈现高峰,从检出季节分布显示A2b型主要在冬春季节流行,而B2型主要在春夏季流行.135例hMPV长沙株分为A型和B型两个主要的基因型,其中A2b亚型在2007-2008年为优势流行型别,2009 -2010年A2b和B2型共同流行,B2亚型在2011年呈优势流行型别.135例hMPV检出阳性患儿中有66例(48.9％)存在混合病毒感染,其中与HBoV混合检出率高.结论 长沙地区部分儿童的急性下呼吸道感染与hMPV有关,且阳性检出患儿年龄主要集中在1岁以下,男多于女,主要流行季节在春季,A2b型和B2型优势基因型在长沙地区共同流行,与其他病毒混合检出率较高.
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苏州地区呼吸道患儿感染人类偏肺病毒的回顾性分析
目的 探讨苏州地区儿童人类偏肺病毒的感染情况.方法 采集呼吸道感染患儿的鼻咽部分泌物,采用实时荧光定量PCR技术,检测人类偏肺病毒,回顾性分析苏州地区六年来人类偏肺病毒的感染情况.结果 17 828例患儿共检出人类偏肺病毒感染1184例,阳性率为6.44％,男、女童感染率分别为6.79％和6.38％.结论 男、女童之间的感染率差异无统计学意义,学龄前儿童感染率要高于学龄期儿童.
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实时荧光逆转录聚合酶链反应检测人类偏肺病毒方法的建立与应用
目的 建立一种快速、准确、特异的实时荧光逆转录聚合酶链反应方法(PCR),以检测人类偏肺病毒.方法 根据Hmpv-L基因序列设计引物和探针并对实时荧光PCR反应体系进行优化,提取总RNA,通过随机引物进行反转录反应;产生的cDNA通过实时荧光PCR进行鉴定.进一步评价实时荧光反转录PCR方法的特异性、灵敏度、重复性,对180例临床样本进行检测.结果 本实验所建立的实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测人类偏肺病毒;该方法的灵敏度可达到1拷贝/μl;检测的批间和批内的变异系数均小于5%.180例肺炎和支气管炎患儿痰标本中共检测出28例人类偏肺病毒阳性,阳性率为15.56%(28/180);肺炎患儿检出率为15.60%(17/109);支气管炎患儿检出率为15.49%(11/71).男性患儿检出率18.56%(18/97),女性患儿检出率12.05%(10/83).患儿年龄小于2岁者检出率22.34%(21/94),2～5岁者检出率8.70%(6/69),大于5岁者检出率5.88%(1/17).结论 本研究建立的人类偏肺病毒实时荧光逆转录PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强;人类偏肺病毒已成为小儿呼吸道感染的重要病原体之一.
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多重实时荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道新发病毒方法的建立与应用
目的 建立儿童新发呼吸道病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法,并利用该方法进行临床标本的检测.方法 根据人类偏肺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、人博卡病毒、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒的保守区域设计并合成引物和探针,确定引物和探针的特异性,优化引物和探针的组合浓度,通过检测具有类似临床症状的其他病原体的标本评价该多重荧光定量PCR方法的特异性,构建质粒标准品用于分析检测该方法的灵敏度和重复性；并对2009至2012年湖州市妇幼保健院及湖州市中心医院收集的322例呼吸道感染患儿的痰液标本进行检测分析.结果 成功建立了这6种新发呼吸道病毒的多重荧光定量PCR检测方法,能够同时或分别对其进行检测.体系中筛选的引物和探针具有很好的特异性,并优化出适合的引物探针组合浓度,灵敏度分析低检测限为10拷贝数/μl,重复性分析中批内变异系数(CV)为1.2％ ～ 3.4％,批间CV为0.08％～0.85％,均小于5％.322份临床标本中,人类偏肺病毒阳性17份,阳性率5.28％,人博卡病毒9份,阳性率2.80％,未检到冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒.结论 多重荧光定量PCR方法具有简单快速,灵敏性和特异度高等特点,并且能实现多种新发病毒同时并行检测,可为儿童呼吸道新发病毒感染的临床诊治提供技术支持.
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深圳地区儿童呼吸道感染人类偏肺病毒检出及鉴定
目的 应用呼吸道感染常见病毒快速筛查技术检测人类偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV),并对检出的hMPV进行分子生物学鉴定.方法 采用Luminex 100多功能悬浮点阵检测技术和多重PCR技术同时筛查检测呼吸道合胞病毒、流感病毒、人类偏肺病毒等7种病毒、11个亚型.人类偏肺病毒的鉴定采用hMPV核蛋白基因特异性片段PCR扩增、核酸测序,并进行进化树分析.结果 47份临床标本共筛查出病毒19株,检出率40.2%(19/47),其中呼吸道合胞病毒8份、占检出病毒的42.1%(8/19),流感病毒7份(占36.8%),副流感病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、人类偏肺病毒各1份(占5.3%).检出的这例人类偏肺病毒为深圳地区首例,经hMPV核蛋白基因特异性片段核酸序列分析,其与hMPV日本株、北京株、泰国株的同源性＞98%.进化树分析表明深圳株的病毒核蛋白基因与北京株、日本株、泰国株等在同一基因进化簇中.结论 人类偏肺病毒可能是儿童呼吸道感染的主要病毒之一,应引起临床的重视.多功能悬浮点阵和多重PCR技术对病毒感染件疾病的快速筛查具有实用价值,尤其在解决流行病病原学分析方面具有重要意义.
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人偏肺病毒基因型双重逆转录PCR检测方法的建立
目的 建立一种鉴别不同基因型hMPV的RT-PCR方法.方法 根据不同基因型的hMPV G蛋白基因序列设计合成A、B基因型的特异性引物,在一次双重PCR反应中根据扩增产物大小鉴别不同基因型.用该方法鉴别37份hMPV阳性的临床标本的基因型.结果 用hMPV G蛋白编码基因的分型引物进行PCR反应,对已知的hMPV阳性标本直接进行分型得到的扩增产物大小易于区分;对常见的呼吸道病毒无非特异扩增,显示引物特异性良好.对37份临床标本进行基因分型结果显示,20份A基因型分型结果与M基因测序分型结果一致,17份经M基因测序分型为B基因型的阳性标本中有14份与M基因测序分型结果一致,3份未得到扩增产物从而不能分型,总符合率为91.9%[(20+14)/37].结论 成功建立了一种可以鉴别不同基因型的hMPV的RT-PCR方法.
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北京地区人群中人偏肺病毒血清抗体水平的初步调查
目的通过对人类偏肺病毒(hMPV)特异性IgG抗体检测,初步了解北京地区人群中该病毒感染的状况.方法以大肠杆菌表达的hMPV 核蛋白(N蛋白)为抗原,用Western-blot检测随机选取的116例血清标本中hMPV N蛋白特异性IgG抗体,以确定表达的hMPV N蛋白的抗原特异性. 随后对1996年4月至1997年3月自首都儿科研究所附属儿童医院和北京宣武医院采集的门诊非呼吸道感染患者及正常儿童的体检血清710例进行hMPV N蛋白特异性IgG抗体检测.结果hMPV N蛋白的抗原特异性试验证明表达的hMPV的N蛋白特异性好.本组710份血清中,抗hMPV N蛋白IgG抗体总阳性率为17.2%(122/710).其中<1个月的婴儿抗体阳性率为13.2%,1个月～的婴儿中抗体阳性率下降至6.1%,2个月～的婴儿中抗体阳性率降至低(3.1%),6个月～的婴儿中抗体阳性率上升至13.9%,在随后的几个年龄段内抗体阳性率维持在13.0%左右,30岁以后的人群中抗体阳性率有所升高,30岁～人群中达28.1%,40岁～人群中达32.3%,≥50岁的人群中达38.5%.结论研究中所应用的hMPV N蛋白的抗原特异性好;抗体的检测结果提示在北京地区的人群中hMPV的感染并不少见,血清抗体阳性率低的年龄组与文献报道感染发生率高的年龄组相符.
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重庆地区儿童血清偏肺病毒中和活性的研究
目的 初步分析重庆地区0～6岁儿童血清人偏肺病毒(hMPV)中和活性及与hMPVIgG抗体水平的关系,为进一步大样本的血清流行病学研究奠定基础.方法 0～3岁儿童血清来自因外科疾患住院的儿童,3～6岁儿童血清来自托幼儿童体检血清.采用微量中和实验检测上述血清中hMPV中和活性,分析血清中和活性水平及其与hMPV IgG抗体水平的相关性.结果 在抽取的50份血清标本中,此前通过间接酶联免疫吸附试验检测为阴性的8份标本均未显示中和活性,而42份hMPV IgG抗体阳性血清标本中和活性均显阳性,平均中和滴度为1:129.其中0～5个月组中和滴度均值1:160,6～11、12～23、24～35个月和3～6岁组中和滴度均值分别为1:58.9、1:114.9、1:172.8、1:160.血清中抗hMPV IgG水平和中和活性具有显著相关性,r=0.668,但hMPV IgG水平与中和活性并不平行.结论 0～6岁儿童血清中多具hMPV中和活性,但其是否足以预防不同亚型hMPV感染尚待进一步研究.
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偏肺病毒毛细支气管炎的临床研究
目的了解人类偏肺病毒(hMPV) 感染情况及所致毛细支气管炎的临床特征.方法(1)采用RT-PCR方法,对126例毛细支气管炎中经呼吸道常见病原检测阴性的54份鼻咽洗液标本进行hMPV基因检测(扩增+测序); (2) 分析hMPV感染患儿的临床资料.结果 (1)共检测出21份阳性hMPV扩增产物,阳性率为16.7%,占54例呼吸道常见病原检测阴性患儿的39%.(2)21例hMPV毛细支气管炎中幼婴(1～6月龄)占62%;多为低-中度发热(86%);外周血WBC<10.0×109/L者占81%;胸部X线表现为两肺野点片状影和(或)肺气肿影者分别为68%和62%.经临床Lowell评分5例评为重症.hMPV毛细支气管炎患儿组主要临床特征与A亚型呼吸道合胞病毒(hRSV)毛细支气管炎组无区别,仅病程较B亚型hRSV毛细支气管炎组长(P＜0.01).结论 (1)126例毛细支气管炎住院患儿中有16.7%是由hMPV感染引起.(2) hMPV毛细支气管炎的主要临床特征与hRSV毛细支气管炎无明显差异.
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2006-2007年苏州地区儿童呼吸道人类偏肺病毒感染的流行和临床特征
目的 了解苏州地区儿童人类偏肺病毒(hMPV)呼吸道感染的流行情况及临床特征.方法 收集2006年1月-2007年12月我院呼吸科4702例急性呼吸道感染住院患儿的呼吸道分泌物,用逆转录-聚合酶链反应法检测hMPV N基因,随机挑选部分阳性PCR扩增产物进行核苷酸测定并将所测序列在GenBank中进行比较分析.结果 4702例标本中,检测到376份RT-PCR阳性扩增产物,阳性率为8%;2006,2007年hMPV检测阳性率分别为8.4%、7.6%.hMPV检测阳性率分别在1、2、3月和11、12月呈现高峰,hMPV感染患儿的平均年龄为22.56个月,376例hMPV感染患儿中临床诊断为上呼吸道感染12例(3.2%);喉炎8例(2.1%);毛细支气管炎102例(27.1%);肺炎210例(55.9%);哮喘急性发作44例(11.7%).20份hMPV N基因部分核苷酸片断与GenBank中hMPVN基因序列同源性为99%～100%.结论 (1)苏州地区部分儿童的呼吸道感染与hMPV有关.(2)全年均存在hMPV感染,流行高峰在冬春季.(3)hMPV感染的临床特征无特异性.
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重庆地区急性呼吸道感染患儿鼻咽吸取物标本中人偏肺病毒的分离研究
目的 分离新近发现的儿童呼吸道病毒病原--人偏肺病毒(hMPV),并分析其感染的临床表现.方法 选取重庆医科大学儿童医院2004年12月至2005年7月因呼吸道感染住院的患儿,无菌采集鼻咽吸取物.离心后细胞沉淀用直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A/B、副流感病毒1、2、3型等常见呼吸道病毒病原.上清接种于Vero-E6和LLC-MK2细胞,进行hMPV分离,出现细胞病变者,扩增hMPV N、F基因,F基因扩增产物序列递交GenBank.收集并分析hMPV感染患儿的临床资料.结果 收集的86份鼻咽吸取物中,有6份接种Vero-E6和LLC-MK2细胞后出现细胞病变,且用RT-PCR成功扩增出hMPV N、F基因片段,证实hMPV分离成功.在6例阳性标本中,2例收集于冬季,2例春季,2例夏季.6位患儿年龄都小于2岁,诊断为支气管肺炎(2/6)、毛细支气管炎(2/6)、婴幼儿哮喘(1/6)和上呼吸道感染(1/6).副流感病毒3和腺病毒可为协同感染病毒病原.结论 首次在中国内地成功分离获得6株hMPV,从活病毒水平证实hMPV是导致中国儿童下呼吸道感染的病毒病原,hMPV感染的临床表现与呼吸道合胞病毒感染相似.采用病毒分离技术,hMPV在呼吸道感染患儿中的检出率约为7%(6/86).
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北京地区六岁以下儿童急性呼吸道偏肺病毒感染
目的了解北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus,HMPV)的关系.方法对2002年11月～2003年3月,收集的247份经过间接免疫荧光法和病毒分离排除了常见的呼吸道病毒感染的鼻咽洗液标本进行了HMPV基因的检测.用针对HMPV N基因序列设计的特异引物对这247份标本进行RT-PCR扩增,扩增片段经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测.挑选10份阳性扩增产物直接进行核苷酸序列测定,并将所测序列在GeneBank中进行比较分析.结果247份标本中共检测到74份RT-PCR阳性扩增产物,阳性率为30.0%(74/247).74例中临床诊断为肺炎者36例,占48.6%;其次为毛细支气管炎21例,占28.4%;年龄2个月～5岁7个月不等,≤2岁者占83.8%.所挑选的10份N基因扩增产物与GeneBank中同源性高的均为HMPV(87%～99%).10份标本中9份标本的扩增产物之间的核苷酸和氨基酸同源性在95.8%～100%和98.6%～100%,1份标本的扩增产物与其他标本同源性较低,仅为87.3%～89.7%和95.8%～97.2%.结论(1)北京地区部分儿科患者的急性呼吸道感染与HMPV有关;(2)北京地区的HMPV中可能存在不同的基因型.
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人类偏肺病毒在儿童呼吸道感染中的研究进展
人类偏肺病毒(hMPV)是一类新近发现的病毒,与儿童,特别是婴幼儿的呼吸道感染关系密切,可以引起上下呼吸道感染.目前研究发现,hMPV感染在世界范围的传播越来越广,且在儿童中感染率有不断上升的趋势,所以对hMPV进行深入研究有利于查明儿童呼吸道感染的病因,对儿童呼吸道感染的防治有重要意义.
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人类偏肺病毒感染的研究进展
人类偏肺病毒(hMPV)是一种单链负链RNA病毒,属于副黏病毒科,偏肺病毒属中首次发现能感染人类的病毒.病毒感染流行趋向图在各个地区都有不同,同一个流行季节可以有两个病毒谱系流行.感染后可以导致上、下呼吸道感染和喘息性疾病,在儿童和免疫功能低下的群体中往往导致严重呼吸道感染,可与其他病毒合并感染,而隐性感染少见.目前检测hMPV感染的方法主要是RT-PCR,尚没有一种抗病毒药物或者疫苗能够有效治疗和预防hMPV感染.
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利用反向遗传学设计人偏肺病毒活疫苗
人偏肺病毒(HMPV)是引起全世界呼吸道疾病的重要原因·特别是在儿童中.需要HMPV疫苗来预防与婴儿感染相关的严重疾病.首要的策略是研制特别适用于防御呼吸道病毒的鼻腔免疫减毒活疫苗.反向遗传学提供一种高度鉴定的候选减毒疫苗研制方法.本文就利用反向遗传学设计HMPV疫苗的研究进展进行综述.
