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苦参碱对TIM2转基因小鼠肝癌细胞的作用研究
目的:观察苦参碱对TIM2转基因修饰小鼠H22肝癌细胞瘤苗的体内作用.方法:构建小鼠TIM2基因真核表达载体并用以转染H22细胞,经体外稳定筛选后获得TIM2转基因H22肝癌细胞全细胞瘤苗(H22-TIM2),用以建立小鼠肝癌移植瘤模型,观察该瘤苗在小鼠体内的成瘤性和免疫原性;加用药物苦参碱(matrine,M)治疗后,观察苦参碱对其体内抗癌活性的影响.结果:筛选得到的TIM2转基因H22肝癌细胞瘤苗有TIM2 mR-NA及EGFP的稳定表达,此瘤苗接种后,在小鼠体内的成瘤率为41%,远低于H22对照组和H22-EGFP空载体组(H22-EGFP)(后两者成瘤率在92%以上),对小鼠肿瘤的抑制率为69.2%,明显高于苦参碱治疗组(67.5%)和其他各组.同时苦参碱可进一步增强H22-TIM2瘤苗的肿瘤抑制率.H22-TIM2组小鼠的脾指数,CD4+T细胞亚群和CD4/CD8较其他实验组明显增高.结论:TIM2基因修饰H22细胞瘤苗可显著降低H22肝癌细胞在小鼠体内的致瘤性,在体内具有一定的免疫原性,苦参碱可明显改善其体内抗癌活性,为进一步研究TIM2基因在肿瘤免疫中的作用及苦参碱的抗癌机制奠定了基础.
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TIM2基因修饰对H22细胞的抑制作用及苦参碱的增强作用
目的 观察苦参碱对TIM2基因修饰小鼠H22肝癌细胞瘤苗的体内作用.方法 以携带小鼠TIM2基因的真核表达载体脂质体法转染H22细胞,经体外稳定筛选获得TIM2转基因H22细胞瘤苗.建立小鼠肝癌移植瘤模型,接种TIM2转基因H22细胞瘤苗(H22-TIM2组),观察成瘤情况,并设空载体转染的H22细胞稳定表达株和H22细胞作为对照(H22-EGFP组和H22组);同时,分别加用药物苦参碱治疗,观察苦参碱对不同处理组小鼠肿瘤生长情况的影响.结果成功得到TIM2转基因修饰H22细胞,鉴定有TIM2基因mRNA及EGFP的稳定表达.免疫接种小鼠后,在小鼠体内的成瘤率为41.6%,明显低于H22组和H22-EGFP组(后两者成瘤率在91.6%以上)(P＜0.01),小鼠肿瘤的生长速率也较其他各组明显缓慢,实验结束时H22-TIM2组小鼠肿瘤平均体积为(31.34±9.21)mm3,明显小于H22.EGFP组和H22组[(98.25±25.23)mm3和(114.08±36.45)mm3;P＜0.01].接种H22-TIM2细胞对小鼠肿瘤的抑制率为69.2%,加用苦参碱后,抑瘤率达90.6%,明显高于单用苦参碱组(67.5%)及H22-EGFP和苦参碱联用组(70.8%).结论 TIM2基因修饰H22细胞可显著降低H22肝癌细胞在小鼠体内的致瘤性,抑制小鼠体内H22移植瘤的发生和发展,而苦参碱可明显改善其体内抗癌活性.
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冬凌草甲素增强对小鼠H22肝癌细胞免疫杀伤作用的实验性研究
为阐明冬凌草甲素(ORI)抗小鼠H22肝癌中的T细胞免疫应答机制,本研究利用C57/BL6小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型,随机分为荷瘤对照组(PBS组)、ORI高、中、低剂量处理组(75、50、25 mg·kg1·d-1)、阳性对照组(5-Fu组)和空白组(NC组),连续腹腔注射给药12d后处死.以瘤重、抑瘤率观察ORI对移植瘤生长的影响;用乳酸脱氢酶释放法检测对小鼠H22细胞杀伤活性;流式细胞术检测小鼠脾脏细胞中CD4+T细胞分泌IL-17、IL-2 、TNF-α、IFN-γ等细胞因子能力,并检测CD8+T和CD4+T细胞表面PD-1的表达.结果显示:低、中、高剂量ORI处理组和荷瘤对照组比较均有显著性缩小(P＜0.05);ORI能明显提高荷瘤小鼠脾脏细胞对H22细胞的杀伤活性(P＜0.05);抑制CD4+T细胞中细胞因子的分泌,尤其对IL-17和IL-2的抑制为明显,对TNF-α和IFN-γ抑制在ORI高浓度情况下发挥作用;同时,ORI处理组中CD8+T细胞的PD-1表达降低,而CD4+T细胞表面PD-1的表达呈现一定程度的上调.上述结果表明ORI对小鼠H22肿瘤具有明显的体内抑瘤作用,除了直接的杀伤作用外,ORI还可以通过提高CD8+T的杀伤作用,降低CD4+T细胞的炎症特性发挥抗肿瘤免疫应答功效,其中的可能机制是影响两种细胞表面PD-1的表达.因此,ORI还可通过协同T细胞抗肿瘤免疫应答机制促进对肿瘤的抑制作用.
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小鼠TIM2基因真核表达载体的构建及鉴定
目的: 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2, 并在小鼠肝癌细胞系H22中进行表达.方法: 用RT-PCR法扩增得到TIM2基因, 构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2, 并进行BamH I及Bgl Ⅱ双酶切鉴定和测序.通过脂质体法转染H22细胞, 用RT-PCR法检测H22细胞中TIM2 mRNA的表达.结果: 构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2, 用脂质体法转染H22细胞后, 用荧光显微镜观察和RT-PCR法检测, 可见细胞内有EGFP及TIM2 mRNA的表达.结论: 成功地构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-TIM2, 并在小鼠H22细胞中表达, 为进一步研究TIM2在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.
