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噬菌体展示技术与中药活性成分靶点蛋白筛选研究
噬菌体展示技术是将所需多肽/蛋白从大量变异体的集落中提取出来的一种高通量的体外筛选技术,因其高效、实用、便捷的优势现已广泛应用于药物研发的多方面领域,在中药活性成分靶点蛋白中也有越来越广泛的应用.靶点蛋白是药物分子在体内的结合位点,良好的靶点是获得优良药物的基础.该文综述了噬菌体展示技术的研究进展及其在中药活性分子靶点蛋白筛选中的应用.
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柴胡皂苷及其代谢产物潜在靶点蛋白预测和部分验证
目的 以柴胡的主要药效/毒性成分柴胡皂苷(SS)及代谢产物(共30种化合物)为研究对象,预测并验证部分靶点蛋白.方法 ①通过PharmMapper反向分子对接法和Sybyl X正向分子对接预测SS及其代谢产物的潜在靶点蛋白,并预测了柴胡皂苷a(SSa)与潜在靶点蛋白谷胱甘肽S转移酶A2(GST A2)间的结合模式.②体外实验:用SSa 0,0.03,0.06,0.13,0.25和0.50 mmol·L-1处理HepaRG细胞24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率;HepaRG细胞用SSa 0,0.03,0.13和0.50 mmol·L-1处理24 h,GST活性检测试剂盒检测细胞GST酶活性.结果 ①PharmMapper和Sybyl X预测SS及代谢产物的潜在靶点蛋白包括:GST A2、磷脂酰胆碱转移蛋白、腺苷激酶、胸苷酸合成酶、雌激素受体、雌二醇17-β-脱氢酶1、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim1、胆汁酸受体和维A酸结合蛋白2.预测结果显示,SSa与GST A2之间对接得分高,二者匹配良好,很可能存在相互作用.②体外实验:SSa能抑制HepaRG细胞存活,呈一定的量效关系(R 2=0.8848,P<0.05);随着SSa浓度升高,细胞内GST活性升高(P<0.01).结论 SS及其代谢产物的潜在靶点蛋白为GST和磷脂酰胆碱转移蛋白等,GST可能是SSa的靶点蛋白之一.
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质谱法在抗肿瘤靶点蛋白的外源性化学修饰研究中的应用
许多研究证明,某些具有迈克尔反应活性的化合物对于肿瘤细胞中靶点蛋白作用的化学生物学物质基础通常源于其对后者进行的化学共价修饰,从而破坏了后者正常的生物学功能并且诱导肿瘤细胞死亡.鉴于质谱法已成为研究化学小分子与生物分子共价修饰作用的一种主流手段,本文将主要综述如何采用药物分析学中的重要技术手段--质谱法进行抗肿瘤靶点蛋白的外源性化学修饰研究.
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筛选和鉴定抗卵巢癌活性六肽的靶点蛋白
目的：采用 pull-down技术筛选乳源抗癌六肽( PG-PIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上的靶点蛋白(受体)并进行鉴定。方法以 PGPIPN 的序列为参照，设计出 PG-PIPN基因，以BamH Ⅰ/Xho Ⅰ为酶切位点，将PGPIPN基因构建到表达质粒载体pGEX-4T-1中，转化到E. coli BL21中，用诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG)低温诱导表达的谷胱甘肽S转移酶( GST)标签融合蛋白作为诱饵蛋白；从SKOV3中提取的总蛋白作为捕获蛋白，运用 GST pull-down技术，筛选出靶点蛋白质，运用SDS-PAGE电泳进行初步鉴定，并用异硫氰酸荧光素( FITC)标记的PGPIPN孵育鉴定。结果 SDS-PAGE 电泳中有两条条带，一条为诱饵蛋白，一条为目的条带，在免疫荧光显微镜下观察到荧光PG-PIPN结合到该条带上。结论筛选和鉴定了PGPIPN作用于卵巢癌细胞上的靶蛋白，为研究其抗癌的作用机制及其信号转导通路奠定了基础。
关键词： 乳源抗癌六肽 GST pull-down 诱饵蛋白 捕获蛋白 靶点蛋白 -
基于脂代谢靶点蛋白hPPAR γ-LBD的抗肿瘤药物筛选模型的研究
目的:建立一种以脂代谢靶点蛋白hPPAR γ-LBD重组蛋白进行抗肿瘤药物筛选的方法.方法:采用pReceiver-B01-PPARγ-LBD表达质粒转至E.coli BL21(DE3)细胞,进行表达与纯化得到可溶性靶点蛋白hPPARγ-LBD重组蛋白,以罗格列酮为hPPARγ-LBD的阳性配体,以GW9662作拮抗剂,采用分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)测定hPPARγ-LBD重组蛋白与配体药物的结合活性.结果:在优化条件(16℃、0.6mmol/LIPTG、诱导20 h)下,能可溶性表达hPPARγ-LBD重组蛋白;经镍亲和色谱纯化后,以每升LB培养基计可获得41 mg、纯度为95%的hPPARγ-LBD重组蛋白;该重组蛋白与罗格列酮特异性结合率约65%,Kd值为625 nmol/L;与德氮吡格(Tetrazanbigen,TNBG)特异性结合率约60%,Kd值为1 000nmol/L.结论:本文基于脂代谢靶点蛋白hPPARγ-LBD建立了抗肿瘤药物体外筛选模型的方法,该方法快速、稳定、安全及简便,能应用于抗肿瘤药物的筛选.
