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发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro
为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV) 核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响.将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况.IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位.提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状.
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抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备和功能分析
为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗的杂交瘤细胞株.用免疫荧光法和免疫沉淀方法对制备的单克隆抗体的抗原特异性进行鉴定,并初步进行单抗效价、中和活性及亲和力等功能分析.结果显示,通过细胞融合和克隆化,共筛选出13株稳定分泌抗糖蛋白(Glycoprotein,GP)单抗和7株稳定分泌抗核蛋白(Nucleoprotein,NP)单抗的杂交瘤细胞株.免疫荧光和免疫沉淀鉴定显示获得的单抗有良好的抗原特异性.抗GP单抗中6株针对Gn,7株针对Gc,大部分的间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)滴度在1 280～20 480之间,其中4株抗Gn单抗具有中和活性.获得的7株抗NP单抗均与NP特异性结合,IFA滴度范围在5 120～20 480,均无中和活性.此外,经非竞争ELISA检测的两株抗GP单抗(1C8和1G8)均有较高亲和力.本研究为SFTS诊断方法的发展及SFTSV致病机制研究奠定了基础.
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发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究
为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glyeoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测.浓缩纯化的SFTSV火活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度.然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新两兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果.结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP.浓缩后的纯化病毒纯度达90％以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态.纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组.本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索.
关键词： 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) 灭活病毒 分子筛层析 纯化 免疫原性 -
基于上转化发光免疫层析技术建立发热伴血小板减少综合征病毒总抗体快速检测方法
目的：基于上转化发光（UPT）免疫层析技术，建立发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）总抗体的现场快速检测方法。方法将 SFTSV 重组 NP 蛋白与上转化发光颗粒（UCP）偶联，制备 UCP-NP 免疫层析试纸条，评价该试纸条检测SFTSV 总抗体的灵敏性、特异性和稳定性，并检测 SFTSV 血清254份，与酶联免疫法（ELISA）比较。结果该方法可在15 min内完成 SFTSV 总抗体检测，可检测1∶500稀释度的 SFTSV 阳性血清，与其他出血热病毒无交叉反应，加样14 d 内稳定性较高。UPT 免疫层析法与 ELISA 法检测临床血清样品一致性极高（Kappa＝0.967），约登指数为0.973。结论建立了基于 UPT 免疫层析技术的 SFTSV 总抗体快速检测方法，该方法灵敏、特异，且操作简便、快速，结果稳定，适合在基层门诊和体检现场推广。
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发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白 NSs的原核表达及初步鉴定
目的：克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV）非结构蛋白 NSs，对其功能初步鉴定。方法采用 PCR 法扩增经密码子优化后的 SFTSV NSs 基因，并克隆至 PGEX-4T-2载体中，构建原核表达载体 PGEX-4T-2-NSs，经酶切、测序鉴定后转化表达菌 BL21（DE3），再经诱导、纯化得到谷胱甘肽 S-转移酶（GST）-NSs 融合蛋白，用 Western Blot 验证融合蛋白 GST-NSs 的抗原性。结果成功构建了 GST-NSs 融合蛋白原核表达载体，并在 BL21细菌中获得高效表达；纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了 SFTSV 重组 NSs 蛋白的原核高效表达，为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。
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2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查
目的 了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主.方法 2012年3月～12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离.结果 采集761只(管)动物,43只(管)检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65％.采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31％.鼠的病毒携带率高(6.84％),蜱标本阳性率高(4.94％).除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23％,不同器官阳性率分别为淋巴结(50.00％)、血清(2.34％)、脾(1.64％)、心(1.64％)、肝(1.28％)、肺(1.09％)、脑(0.94％)、肾(0.73％)、血块(0.41％).5月标本阳性率高(4.01％).从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒.结论 鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介.
关键词： 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) 实时荧光RT-PCR 宿主 媒介 监测 -
发热伴血小板减少综合征病毒在鼠体内携带情况的调查
目的 调查了解发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的宿主动物和传染源,为该传染病的防治工作提供科学依据.方法 采用鼠笼法在发病区野外及居民区内捕鼠计算鼠密度;采用荧光定量RT-PCR检测鼠体内SFTSV核酸.结果 野鼠密度较高(20.42％),家鼠密度相对较低(6.45％).黑线姬鼠总带毒率9.52％,其心、肝、脾、肺、肾、脑6种脏器均带毒,尤以肝脏高,心、脾、肺、肾次之,脑带毒率低;家鼠总带毒率12.00％,只有脑、心、肺3种脏器带毒,其中以脑的带毒率高.结论 初步认为鼠类是SFTSV的宿主动物之一,但其在该病传播过程中所起的作用有待进一步证实.
关键词： 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) 宿主动物 带毒率
