首页 > 文献资料
-
风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价
原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性.将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1 aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别.分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgMELISA血清学检测中.
-
模拟表位型EB病毒感染诊断抗原的制备
目的 利用大肠埃希菌表达系统获取模拟表位型诊断抗原用于EB病毒(epstein-Barr virus,EBV)感染的早期诊断,并初步评价其抗原性.方法 将EB病毒模拟表位GP125、F1、A2、A3 C2多肽序列用特定连接臂串联,密码子优化后全基因合成;将目的片段插入带有Trx标签的表达质粒中,在大肠埃希菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western blot技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立EBV-IgM抗体检测捕获法ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 所获取EBV模拟表位诊断抗原浓度为2.8 mg/ml,纯度为99.01％;Western blot实验发现,以anti-Trx单克隆抗体或EBV-IgM阳性血清作为第一抗体,在NC膜约26×103处都可以发现特异条带(与预期一致);对50份EBV急性感染阳性血清和50份阴性血清进行检测得出,阳性血清样本OD值1.352 (95％ CI:1.233 ～1.489)与阴性血清样本OD值0.135(95％ CI:0.113 ～0.159)分布区组明显(P＜0.05),其中灵敏度为98.0％,特异性为96.0％,一致性检验kappa值为0.940,一致性优异.结论 原核表达与亲和及离子交换层析纯化可以获取抗原性良好的EBV感染诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于EBV-IgM捕获法ELISA血清学检测中.
-
组分无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立
目的:建立适合大规模生产的组分无细胞百日咳疫苗(acellular component pertussis vaccine,ACPV)纯化新工艺,从百日咳杆菌发酵液中分离纯化百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)3种抗原组分.方法:百日咳杆菌发酵液经离心分离上清和菌体,上清通过超滤浓缩后,经多模式阳离子交换介质Eshmuno(R) HCX和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PT;菌体经高盐缓冲液浸提后离心,浸提上清经阳离子交换介质Capto SP ImpRes和羟基磷灰石介质CHT两步层析获得FHA;浸提沉淀采用尿素抽提和硫酸铵盐析后,经复合型阴离子交换介质Capto Adhere和阳离子交换介质Capto SP ImpRes两步层析获得PRN.采用该工艺连续生产3批ACPV,检测各项指标,验证该工艺的重复性.结果:经该工艺得到的3种抗原组分完整性好且纯度均在95％以上,层析工艺平均回收率可达60％以上,FHA和PRN抗原均可通过特异性毒性检查;建立的纯化新工艺具有良好的重复性.结论:采用柱层析方法从百日咳杆菌培养物中分离纯化出了3种高纯度的百日咳抗原成分(PT,FHA和PRN),该方法适用于大规模生产,为以组分百白破疫苗为基础的联合疫苗的研发奠定基础.
-
两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较
目的 比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果.方法 将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围.取抗原含量高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量.结果 Sepharose 6FF填料按6％柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69％、78.03％和78.37％,与Sepharose CL-6B填料按3％柱体积上样(77.29％、78.60％和77.36％)相比,差异无统计学意义(P＞0.05).两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论 使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B.
-
甘油磷酸胆碱的层析纯化及其稳定性研究
目的 对甘油磷酸胆碱粗品进行层析纯化,并对其进行稳定性研究,从而为工业化生产、包装、贮存和制剂的研发提供依据.方法 采用三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行层析纯化;设计影响其稳定性试验:分别取三份GPC(批号为100301、100302、100303)光线强度为4 500 LX的强光照射10 d,60℃高温放置10 d,温度25℃、相对湿度75%放置10 d,密闭于40℃、相对湿度75%的器皿中放置12月的加速试验,密闭于25℃、相对湿度75%的器皿中放置12月的长期试验并做重复试验,采用色谱柱为GraceSmart RP C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为60%乙腈-水溶液,检测其含量变化.结果 通过三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺进行分离纯化,能得到纯度达99.5%以上的甘油磷酸胆碱产品;强光试验含量均数为99.51%(n=9)、RSD=0.40%,高温试验含量均数为99.65%、RSD=0.42%(n=9),高湿试验含量均数为99.30%、RSD=0.47%(n=9),加速试验含量均数为99.61%、RSD=0.57%(n=15),长期试验含量均数为99.12%、RSD=0.50%(n=15),重复试验含量均数为99.68%、RSD=0.43%(n=5).结论 层析纯化度高,工艺简单,可操作性强,适用于工业化生产;甘油磷酸胆碱的稳定性好,且采用的稳定性测定方法灵敏、准确、重现性好.
-
白芷多糖的提取纯化及其对仓鼠肺细胞生长作用的研究
目的:研究白芷多糖(ADP)的提取纯化及其对中国仓鼠肺细胞(CHL)生长作用的影响.方法:提取ADP,经Sephadex G-50、G-200层析纯化,用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)比色法检测ADP对体外培养的CHL细胞生长增殖的作用.结果:经Sephadex G-50、G-200层析纯化后,分子量范围为1000～200000的ADP在50、100、500μg/m1对CHL细胞的生长增殖均有促进作用.结论:ADP对体外培养的CHL细胞增殖具有促进作用.
