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鸡马立克氏病病毒流行毒株高代次细胞毒株Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因变异分析
根据鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)GA株的全基因组序列,设计合成了用于扩增MDV Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因的引物,分别扩增4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株(L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C)及相应亲本毒株(L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY)、MDV强毒J-1株、81 4疫苗株等10个毒株的Meq、RLORF4、RLORF1 2和132bpr基因.经克隆测序后,分析4个高代次细胞毒株中相应基因的变异,并与MDV强毒J-1株、814疫苗株及GenBank中已发表MDV毒株的相应序列进行比较.序列比对分析发现,L-CZp75C株Meq基因的第625位存在碱基C插入突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且第602位缺失碱基T,从而致使Meq基因推导的相应氨基酸序列在第177～200位发生移码突变.L-SYp85C株RLORF4基因在第215～265位缺失51bp,致使该基因推导的氨基酸序列相应缺失17个氨基酸残基.分析RLORF12基因序列,发现L-MSp75C株在第67位存在碱基T缺失,814疫苗株在第18～86位缺失69 bp,缺失位置均位于复制起点(Origin of replication,Ori)内;而L-ZYp75C毒株在RLORF12基因第168～174位存在独特的TGTTGGG碱基缺失.4个细胞高代次毒株的132 bpr基冈的扩增结果表明,该基因在病毒基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上.上述分析结果提示,4株MDV流行强毒株经体外连续传代后,MDV致瘤相关基因Meq、RLORF4、RLORFl2和132bpr基因等发生了缺失突变或插入突变.
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鸡马立克病病毒Meq蛋白抑制p53的转录激活作用
目的 构建鸡马立克病病毒野生型Meq基因(Meq-wt)和p53结合区域缺失的突变型Meq基因(Meq-mut)表达质粒,研究Meq蛋白对p53转录激活功能的影响,为进一步了解其生物学功能奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法克隆鸡马立克病病毒Meq-wt基因,并采用突变PCR方法缺失Meq与p53结合区域,分别构建了Meq-wt和Meq-mut基因表达质粒.转染鸡胚成纤维细胞(Cer)后,用Western印迹法检测Meq蛋白的表达,利用荧光素酶报告基因系统证实Meq蛋白对p53转录激活的抑制作用.同时借助免疫荧光技术,采用荧光显微镜观察Meq蛋白与p53蛋白在细胞中的定位.结果 DNA序列测序表明克隆的Meq-wt、Meq-mut基因插入位点和核苷酸序列完全正确.荧光素酶报告基因系统证实Meq蛋白对p53转录激活具有明显的抑制作用.间接免疫荧光试验证实野生型Meq蛋白主要在胞质中表达,而缺失与p53结合区域的突变型Meq在胞质/胞核中均有表达.野生型Meq蛋白与内源性p53蛋白在胞核内能够很好地重合.结论 Meq蛋白对p53的转录激活具有抑制作用,可能是通过直接与p53相互结合,来抑制对p53的转录活性.
