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戊型肝炎病毒ORF1多聚蛋白的不同功能域在细胞内的定位
为了探讨戊型肝炎病毒多聚蛋白ORF1的多个功能域在宿主细胞中的表达和定位情况,我们首先将psk-HEV重组载体上的ORF1各功能域的编码序列克隆到绿色荧光蛋白载体pcDNA3.1-GFP上,构建成融合表达的重组质粒,并测序和酶切鉴定其构建成功.再通过Western-Blot验证各融合蛋白在细胞中正确表达,并用激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布和定位.在Huh7细胞中,RdRp蛋白主要分布于细胞核内,HEL蛋白以囊泡状分布于细胞核周,MET蛋白以颗粒状存在于细胞核和细胞质中,PLP蛋白呈极性分布于细胞核周,X蛋白在细胞核和细胞质中均存在.各融合蛋白在细胞中的不同定位印证了对这些蛋白质的功能预测和体外研究结果,这为进一步研究HEV不同蛋白功能提供了支持.
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戊型肝炎病毒ORF3蛋白功能的研究进展
戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒(HEV)引起的经肠道传播的病毒性肝炎.对HEV结构蛋白的深入研究有利于病毒感染机制的明确和疾病的预防.ORF3蛋白作为HEV结构蛋白之一,其具体功能目前仍不太清楚.一直以来,针对该蛋白的研究非常少,近年来研究发现HEY ORF3蛋白在细胞信号转导、病毒感染和免疫抑制等方面都有非常重要的作用.
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戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞及其稳定表达
目的 将戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞,建立能稳定表达ORF3蛋白(pORF3)的细胞株.方法 将ORF3基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-ORF3.电穿孔法将其导入HeLa细胞中,G418筛选得到稳定抗性的细胞株,并用RT-PCR和Western印迹法分别从mRNA水平和蛋白水平检测ORF3的表达.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3-ORF3,并筛选获得能稳定表达pORF3蛋白的HeLa细胞株.结论 pORF3蛋白能够在HeLa细胞中稳定表达,为进一步研究其生物学功能奠定了实验基础.
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基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸变异的初步探讨
目的 初步探讨戊型肝炎病毒(HEV)ORF3蛋白氨基酸变异情况,为其功能研究提供相关线索.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增41株基因4型HEV RNA ORF3基因片段,将PCR产物与pMD18-T Vector连接,转化到大肠埃希菌JM109筛选阳性克隆测序,然后采用DNAstar软件将测序结果翻译成氨基酸序列,初步探讨其变异情况及与基因1型HEV ORF3蛋白差异.结果 19株HEV RNA ORF3扩增阳性,其长度均为345bp,编码蛋白含有114个氨基酸,共19个位点突变,突变分布于D2区、P1区和P2区,D1区无突变;与基因1型HEV ORF3蛋白比较,基因4型HEV ORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区均存在一个或多个氨基酸突变,P2区两个PXXP基序无突变.结论 与基因1型HEV ORF3蛋白比较,基因4型HEV ORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区氨基酸均存在突变,这些变异是否影响我国基因4型HEV ORF3蛋白结构和功能仍需进一步研究;但P2区两个PXXP基序高度保守,推测其可能在不同型HEV致病过程中起着重要的作用.
